Para realizar la siembra de organoides, primero, retire el sobrenadante de la centrífuga y lave las células de carcinoma hepatocelular. Vuelva a suspender las células en los 50 microlitros de extracto de membrana basal, o BME, por pocillo, para la siembra. A continuación, suspenda las celdas en DMEM/F12 avanzado.
A continuación, pipetee suavemente los agregados celulares hasta que se vea una suspensión uniforme. Agregue BME a la suspensión, asegurándose de que la concentración de BME esté entre el 30 y el 50%Ahora siembre 50 microlitros de gotas de BME con grupos de células en el centro de una placa de 24 pocillos. Deje que las gotas se solidifiquen a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
Agregue 500 microlitros de medio precalentado a cada pocillo e incube en una incubadora de celdas a 37 grados centígrados. Refresque el medio de cultivo cada dos o tres días. Después de dos semanas, reemplace el medio de aislamiento con el medio de expansión del organoide.
Después de siete a 10 días de cultivo, una vez que los organoides hayan alcanzado la densidad adecuada, procese los cultivos según sea necesario. Para pasar los organoides, primero precaliente las placas de cultivo celular de superficie de adhesión ultra baja en una incubadora. A continuación, descongele el BME congelado durante la noche a cuatro grados centígrados hasta justo antes de su uso.
Precalentar la solución de recolección de organoides y el sustituto de tripsina a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la etapa de preparación, retire el medio de cultivo de la placa de cultivo de organoides. Luego, transfiera la suspensión de organoides a un tubo de 15 mililitros.
Ahora agregue la solución de recolección de organoides en proporción a la cantidad de BME. Para mezclar la suspensión, use una pistola de pipetas de 1000 microlitros para raspar y pipetear hacia arriba y hacia abajo. Después de incubar el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos, utilice una pipeta de un mililitro para aspirar cuidadosamente el BME.
Asegúrese de que el BME esté completamente disuelto. Controle el extracto cada 10 minutos hasta que se vea un grupo de células organoides claras. A continuación, centrifugar a temperatura ambiente a 400 g durante cinco minutos.
Retire la mayor cantidad posible del sobrenadante. Para iniciar la digestión enzimática de los organoides del carcinoma hepatocelular, agregue de uno a cinco mililitros del sustituto de tripsina precalentado al gránulo de organoide cultivado. Incubar la suspensión a 37 grados centígrados durante dos minutos.
Use un microscopio para verificar si los organoides se disocian en pequeños grupos de dos a 10 células. Para detener la digestión, agregue un volumen adecuado de medio basal frío. A continuación, centrifugar los organoides a 400 g durante cinco minutos a ocho grados centígrados.
Retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante. Vuelva a suspender el número deseado de organoides en la matriz adecuada para el recubrimiento. Cada 10 días pasan los organoides, dependiendo de la densidad de crecimiento de los organoides.
Se observaron esferoides de organoides de HCC a los tres días de cultivo. Se observaron esferoides compactos con bordes redondeados y citosol permeable en el día inicial de establecimiento. Los organoides tenían un tamaño similar y tenían el diámetro más grande cuando se cultivaron en 30 a 50% de BME.
El BME fue el más fragmentado con un 10%, lo que resultó en los organoides más pequeños. El BME estaba más intacto al 100%, pero dio lugar a organoides con diámetro intermedio. El organoide HCC en proliferación alcanzó un tamaño superior a los 500 micrómetros en cada cultivo después de tres generaciones.
Se obtuvieron organoides de HCC de tamaño sustancial de más de 1000 micrómetros dentro de un período de cultivo de 20 días.
