Después de encender el microscopio confocal equipado con objetivos de inmersión en aceite de 40x y 63x, coloque el portaobjetos en la platina del microscopio. Para obtener imágenes de los progenitores musculares asociados al disco del ala y los músculos de vuelo indirecto o IFM, establezca DAPI con una excitación de 405 y una emisión de 450 nanómetros. A continuación, seleccione Alexa Fluor 488 con una excitación de 496 y una emisión de 519 nanómetros, y Quasar 670 para las sondas smFISH con una excitación de 647 y una emisión de 670 nanómetros.
Localice la muestra utilizando una señal DAPI y una lámpara UV. Guarde las imágenes capturadas como archivos TIFF. Para obtener imágenes de las células madre musculares adultas, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión para DAPI y Alexa Fluor 488 como se demostró anteriormente.
A continuación, ajuste las longitudes de onda de Alexa Fluor 555 y Quasar 670 para las sondas smFISH. Localice la muestra y guarde las imágenes capturadas como TIFF. Inicie la imagen J y navegue hasta el menú de complementos.
Seleccione Macros y, a continuación, Editar para abrir el código fuente de las macros. Para cuantificar las manchas Mef2 smFISH en larvas, establezca el radio logarítmico en tres y la calidad logarítmica en 20. A continuación, segmente los núcleos positivos de Mef2 con un desenfoque de dos, un parámetro de escala de núcleo de 30, un umbral de núcleo de menos ocho y un tamaño de núcleo de 300.
Inicie la macro ejecutando el comando run. La macro cargará automáticamente todas las imágenes de la carpeta designada y las cuantificará secuencialmente. En fibras musculares, establezca el radio logarítmico en 2,5, la calidad logarítmica en 60, el desenfoque en dos, el parámetro de escala del núcleo en 100, el umbral del núcleo en cero y el tamaño del núcleo en 300.
Inicie la macro ejecutando el comando run. La macro cargará automáticamente todas las imágenes de la carpeta designada y las cuantificará secuencialmente. Después del análisis, verifique los resultados que se muestran en el archivo FISH results y en el archivo de resultados de núcleos.
Los transcritos Mef2 y Zfh1 se detectaron uniformemente en la población de AMP y se colocalizaron con las proteínas Mef2 y Zfh1 respectivamente. Un mayor aumento de los AMP distinguió entre los focos de los sitios de transcripción y el ARNm maduro disperso en el citoplasma. Del mismo modo, se examinaron el sitio de transcripción y la distribución del ARNm de Mef2 y Zfh1 en IFM adultos diferenciados y células madre asociadas.
La macro de imagen J construida internamente detectó y segmentó eficazmente los puntos Mef2 y los núcleos musculares. El análisis cuantitativo del ARNm de Mef2 por núcleo en IFMs adultos y los AMPs no fueron significativamente diferentes. La cuantificación de la distribución de la mancha Mef2 mostró que el 92% del ARNm de Mef2 está presente en el citoplasma y el 8% está asociado con núcleos musculares.
