Para comenzar, seleccione una placa de 24 pocillos que contenga insertos con filtros de 0,4 micras. Con una pipeta, agregue 500 microlitros de HBSS debajo y por encima de los insertos del filtro. A continuación, cierre la placa de pocillos múltiples y colóquela en una incubadora durante dos horas.
Después de la incubación, aspire con cuidado el HBSS de la placa. Prepare una solución de colágeno libre de células en un tubo estéril de 50 mililitros en DMEM sobre hielo. Agregue 250 microlitros de colágeno sobre el filtro de membrana y coloque la tapa en el plato.
Deje que la solución polimerice a temperatura ambiente. A continuación, retire el cultivo de células de fibroblastos L-929 de la incubadora. Agregue dos mililitros de una solución de tripsina EDTA precalentada al matraz y colóquelo en una incubadora durante tres a cinco minutos.
Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros y centrifugue a 645 G durante cinco minutos. Con una bomba de vacío, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de DMEM. Agregue 20 microlitros de suspensión celular en un tubo que contenga 20 microlitros de solución de azul de tripano.
Y use una cámara de conteo de células para evaluar la densidad celular. A continuación, retire el cultivo de células de monocitos U-937 de la incubadora. Centrifugar la suspensión celular y resuspender el pellet en un mililitro de RPMI.
Después de asegurarse de que las células estén suspendidas homogéneamente, cuéntelas utilizando una cámara de recuento de células. A continuación, prepare suspensiones celulares que contengan 50.000 células L-929 y 15.000 células U-937 respectivamente en 50 microlitros de DMEM. Agregue cada suspensión celular de 50 microlitros a 450 microlitros de colágeno y mezcle bien.
Superponga la lámina propia libre de células precodificada con 500 microlitros de la solución de células de colágeno. Cierre la placa y colóquela en una incubadora durante dos horas para permitir que la solución se asiente. A continuación, retire el cultivo de células Caco-2 de la incubadora.
Con una bomba de vacío, aspire el medio y enjuague las celdas con 10 mililitros de PBS. Agregue cinco mililitros de solución de tripsina EDTA PBS y colóquela en una incubadora durante cinco a ocho minutos. A continuación, centrifugar la suspensión celular y resuspender el gránulo en un mililitro de DMEM.
Después de contar, prepare una suspensión celular que contenga 150, 000 células Caco-2 en 50 microlitros de DMEM. Coloque la placa en una campana de flujo laminar durante 10 minutos antes de transferirla a la incubadora. Después de 30 minutos, agregue 500 microlitros del DMEM por encima del modelo reconstruido y 500 microlitros por debajo del filtro y devuelva la placa a la incubadora.
Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el medio con 500 microlitros de DMEM fresco por encima y por debajo del filtro respectivamente.
