Gracias a la Fundación Umberto Veronesi por una beca de apoyo al trabajo de los investigadores.

1. Preparación del modelo básico de mucosa intestinal reconstruida en 3D
NOTA: Todo el procedimiento debe realizarse en una campana de flujo laminar estéril. Todas las etapas del procedimiento que impliquen el uso de la incubadora celular significan que los cultivos se incuban a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene un 5% deCO2 (a menos que se indique lo contrario en el protocolo).
<ol><li>Preparación previa de las líneas celulares utilizadas en el sistema modelo intestinal<ol><li>Siembre células de fibroblastos de ratón L929 a una concentración de 5 x 105 en 5 mL del Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 2 mM de L-glutamina, 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) en un matraz F25 y cultive en una incubadora 4 días antes de la construcción de los modelos intestinales. Después de 48 h, retire el medio con una pipeta. A continuación, añadir medio fresco (5 ml) e incubar las células durante 48 h. NOTA: Las celdas deben tener un 80% de confluentes antes de ser utilizadas.</li>
		<li>Sembrar células de Caco-2 (concentración de 2 x10,6) en 10 mL de medio DMEM (con 10% de FBS y 1% de Pen-Strep) en un matraz de células F75 y cultivarlo en una incubadora 4 días antes de la construcción del modelo de mucosa intestinal. Después de 48 h, cambie el medio como se describe en el paso 1.1.1 y vuelva a incubar durante 48 h hasta una confluencia del 80%. NOTA: Las células deben estar en una fase de proliferación activa: ni demasiado dispersas ni demasiado confluentes. Se recomienda una confluencia del 50-60%. Las células no deben sembrarse el día anterior a la realización del modelo porque esto podría ralentizar la capacidad proliferativa de las células, que entonces no se arraigarían perfectamente en el modelo 3D reconstruido.</li>
		<li>Agregue células U937 que crecen en suspensión (concentración de 1 x 106) a 10 ml de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (que contiene 2 mM de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio, 10% de FBS y 1% de Pen-Strep) en un matraz de células F75 2 días antes de la configuración del modelo, y colóquelo en una incubadora durante 48 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de los insertos de placas de cocultivo de Transwell<ol><li>Seleccione una placa de 24 pocillos que contenga insertos con filtros de 0,4 μm. NOTA: El filtro de 0,4 μm es una opción estándar en los estudios de transporte de fármacos. No se recomiendan los tamaños de filtro de 3 μm y 8 μm para evitar posibles pérdidas de las células incrustadas en colágeno.</li>
		<li>Con una pipeta, hidrate los filtros Transwell (en lo sucesivo denominados insertos de membrana) con 500 μL de solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks por debajo y por encima del inserto filtrante.</li>
		<li>Cierre la placa de pocillos múltiples y colóquela en una incubadora durante un mínimo de 2 h. NOTA: Los insertos de membrana pueden permanecer en el HBSS hasta 24 h. Esta operación se puede realizar el día anterior a la construcción del modelo. Es importante que los insertos de membrana estén completamente hidratados y que el filtro no se seque, ya que esto podría dificultar que la muestra se adhiera correctamente.</li>
		<li>Retire las placas de la incubadora después de 2 h (o 24 h). Aspire cuidadosamente el HBSS por encima y por debajo de los insertos de la membrana con una pipeta y déjelo secar durante 10 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la lámina propia de colágeno libre de células del sistema básico de modelo intestinal en 3D (DÍA 1)<ol><li>Prepare una solución de colágeno libre de células en un tubo estéril de 50 ml sobre hielo que contenga los siguientes componentes en DMEM: 10% de suero fetal bovino (FBS), 200 mM de L-glutamina, 1% de bicarbonato de sodio y 1,35 mg/ml de colágeno de cola de rata tipo 1. NOTA: Todos estos componentes deben mantenerse en hielo y añadirse al DMEM con puntas de pipeta refrigeradas. El colágeno de la cola de rata tipo 1 debe agregarse al final, ya que se polimeriza con el aumento de la temperatura y el pH. La cantidad de solución de colágeno libre de células preparada dependerá del número de equivalentes intestinales requeridos.</li>
		<li>Añadir 250 μL de la solución a cada inserto de la placa (por encima del filtro de membrana) para el número de equivalentes intestinales seleccionados y colocar la tapa sobre la placa de pocillos múltiples. Deje que la solución de colágeno se polimerice a temperatura ambiente (RT) debajo de la campana de flujo laminar. NOTA: Aparte de la transición a una fase más sólida, la polimerización también es evidente por un cambio de color de amarillo a rosa. La polimerización suele completarse en 10-15 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación, recuento celular y adición de células de fibroblastos (L929) y monocitos (U937) al sistema modelo (DÍA 1)<ol><li>Retire el cultivo celular L929 (paso 1.1.1) de la incubadora. Con una bomba de vacío, aspire el medio, reemplácelo con 5 ml de solución salina tampón fosfato estéril (PBS; sin Ca y Mg) y enjuague las células.</li>
		<li>Aspire el PBS con una bomba de vacío. Agregue 2 ml de una solución de tripsina-EDTA preparada previamente (0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA en PBS) y colóquela en una incubadora durante 3-5 minutos.</li>
		<li>Utilice un microscopio invertido (por ejemplo, un Eclipse Ts2, Nikon) para establecer si las células se están desprendiendo de la superficie de adhesión. Si esto ocurre, agregue inmediatamente 2 ml de DMEM (que contenga 10% de FBS) para bloquear la reacción de tripsina y enjuague las células.</li>
		<li>Transfiera la solución celular a un tubo estéril de 15 ml y centrifugue a 645 x g durante 5 min. Con una bomba de vacío, aspire el sobrenadante. NOTA: Es necesario tener cuidado de no alterar el pellet. El efecto del DMEM se probó en las células L929 y U937 y no se demostró que tuviera efectos adversos sobre el crecimiento.</li>
		<li>Agregue 1 ml de DMEM al gránulo y suspenda las células. NOTA: Las células deben estar suspendidas homogéneamente en la solución.</li>
		<li>Retire 20 μL de las células en DMEM y agregue 20 μL de solución de azul de tripano. Retire 20 μL de la mezcla y evalúe la densidad celular microscópicamente utilizando una cámara de recuento celular.</li>
		<li>Retire el cultivo celular U937 (paso 1.1.3) de la incubadora. Centrifugar la solución celular a 645 x g durante 5 min. Con una bomba de vacío, aspire el sobrenadante para evitar perturbar el pellet.</li>
		<li>Suspenda las células en 1 mL de RPMI. Al igual que con las células L929, asegúrese de que las células estén suspendidas homogéneamente en la solución.</li>
		<li>Del mismo modo, establezca la densidad celular como se indica en el paso 1.4.6.</li>
		<li>Prepare una solución de colágeno como se describe en el paso 1.3.1. NOTA: La cantidad de solución a realizar debe tener en cuenta 450 μL para cada inserto (o modelo).</li>
		<li>Preparar una solución de DMEM que contenga un recuento de 50.000 células L929 y 15.000 células U937, respectivamente, en un volumen de 50 μL para cada modelo equivalente intestinal que se vaya a construir. NOTA: El número de celdas es un factor crítico. Demasiadas de ambos tipos de células darían lugar a una lámina propia excesivamente llena de células que no estarían adecuadamente organizadas. Un número menor de fibroblastos (que generan colágeno) daría lugar a una lámina propia menos compacta, mientras que un número insuficiente de monocitos impediría la respuesta inmunitaria a los estímulos. Siempre que haya un recuento correcto de células dentro de cada alícuota de 50 μL, se puede preparar un volumen total de 600 μL para los 12 insertos de filtro presentes en cada placa de 24 pocillos.</li>
		<li>Añadir cada alícuota de 50 μl que contenga las células a 450 μl de solución de colágeno en el paso 1.4.10. Homogeneizar.</li>
		<li>Superponga la lámina propia de colágeno libre de células prerrecubierta con 500 μL de la solución celular que contiene colágeno para cada modelo. NOTA: Es importante agregar rápidamente los volúmenes a cada inserto y, como tal, es aconsejable limitar el número de modelos de mucosa intestinal reconstruidos a 12 o menos a la vez.</li>
		<li>Cierre la placa y colóquela en una incubadora durante 2 h para permitir que la solución se asiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación, recuento celular y adición de células epiteliales Caco-2 al modelo intestinal (DÍA 1)<ol><li>Retire el cultivo celular de Caco-2 (paso 1.1.2) de la incubadora. Repita los procedimientos del paso 1.4.1 utilizando 10 ml de PBS para el enjuague preliminar. A continuación, añadir 5 ml de una solución de tripsina-EDTA preparada previamente (0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA en PBS libres de Ca- y Mg) y colocar en una incubadora durante 5-8 min.</li>
		<li>Repita los pasos 1.4.3 (pero usando 5 ml de DMEM para bloquear la reacción de tripsina) hasta 1.4.6 para contar las células utilizando la cámara de recuento de células.</li>
		<li>Prepare una solución de DMEM para contener un recuento de 150.000 células de Caco-2 en 50 μL. NOTA: El número de celdas utilizadas es un punto crítico. Superar las 150.000 células podría dar lugar a una capa epitelial compacta y desorganizada, mientras que con muy poca (menos de 100.000), las células tienen dificultades para crecer y no cubren adecuadamente la membrana basal creando una capa epitelial intestinal discontinua. Asegúrese de que las células estén suspendidas de manera efectiva. La punta de una pipeta de 200 μL se puede utilizar para garantizar una distribución homogénea. Dado que se pueden construir 12 modelos en un momento dado, se puede preparar una solución celular de 600 μL.</li>
		<li>Después de las 2 h requeridas en el paso 1.4.14, añadir 50 μL de células de Caco-2 suspendidas en DMEM en el centro de cada membrana basal. Cierre la tapa de la placa de pocillos múltiples.</li>
		<li>Incubar bajo la campana de flujo laminar estéril durante 10 min. Luego transfiéralo a la incubadora durante 30 minutos.</li>
		<li>Prepare una solución de DMEM que contenga un 10% de FBS y un 1% de pluma/estreptococo. NOTA: Prepare una solución suficiente para usar un volumen de 1 ml por modelo.</li>
		<li>Agregue 500 μL del medio por encima del modelo reconstruido y 500 μL por debajo del filtro. NOTA: Se requiere cuidado al agregar el medio sobre el filtro para evitar desprender o estresar las celdas.</li>
		<li>Cierre el sistema de placas de pocillos múltiples y colóquelo en la incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación/formación y uso del modelo (DÍA 2 a DÍA 6)<ol><li>DÍA 2: Retire con cuidado la solución tanto por encima del modelo reconstruido como por debajo del filtro con una pipeta. Reemplácelo con 500 μL de DMEM nuevo (10% FBS y 1% Pen/Strep) por encima y por debajo del filtro, respectivamente.</li>
		<li>DÍA 3: Repita como se indica arriba en el paso 1.6.1.</li>
		<li>DÍA 4: Repita como se indica arriba en el paso 1.6.1. NOTA: Este modelo intestinal es un modelo celular estático; Por lo tanto, para favorecer la liberación de moléculas y el crecimiento y estimulación de las células, es muy importante que el medio se cambie todos los días.</li>
		<li>DÍA 5: En este punto, el modelo está completamente formado/desarrollado. Utilice estos modelos para estudios posteriores. NOTA: El mejor momento para usar el modelo es a los 5 días. Aunque las células se pueden mantener en una incubadora durante períodos más largos, cuanto más tiempo pasa, mayor es la probabilidad de que las células epiteliales crezcan de manera descontrolada, lo que resulta en una capa desorganizada y compacta que es difícil de usar.</li>
		<li>A los 5 días, incubar los modelos con componentes tóxicos (gluten o lipopolisacáridos [LPS]) o beneficiosos (polifenoles) de interés. Añádalos a la parte superior del modelo reconstruido suspendido en el medio DMEM. NOTA: La concentración adecuada de cada componente de interés debe calcularse y suspenderse en un medio DMEM. Los controles no tratados que contengan únicamente medio DMEM deben establecerse para su comparación con los modelos experimentales.</li>
		<li>Incubar los modelos control y experimental durante 24 h en una incubadora.</li>
		<li>DÍA 6: Retire el medio por encima y por debajo del filtro con una pipeta. NOTA: El medio se puede almacenar para pruebas posteriores de tipo ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para medir la liberación de citocinas inflamatorias. Para ello, el medio debe añadirse a viales estériles y almacenarse a -20 °C para su posterior análisis.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inclusión en parafina de los modelos de mucosa intestinal reconstruidos
NOTA: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo bajo una campana de gases químicos. Cada paso y la respectiva asignación de tiempo deben cumplirse estrictamente. Por esta razón, es importante tener todos los reactivos preparados con anticipación.
<ol><li>Ajuste la máquina de parafina a 58 °C para que esté lista para su uso.</li>
	<li>Transfiera los insertos de membrana a pocillos limpios con unos alicates en una placa estéril de 24 pocillos.</li>
	<li>Añadir 500 μL de formalina tamponada al 37% en PBS por encima del filtro y 1 mL por debajo del filtro. Cierre la tapa y déjela debajo de la campana de extracción de productos químicos durante 2 h a RT. NOTA: Como alternativa, se puede usar formalina tamponada al 4% en RT durante 1 h.</li>
	<li>Retire la formalina y agregue la solución de HBSS tanto por encima como por debajo del filtro. A continuación, retire el HBSS.</li>
	<li>Separe la lámina propia del inserto de la membrana. NOTA: Las células de la mucosa intestinal suelen desprenderse muy fácilmente del inserto de la membrana ya que no están unidas a esta última. Además, los dos compartimentos de la muestra (apical y basal) permanecen unidos, conservando la estructura 3D. Si, por alguna razón, no se desprenden fácilmente, será importante utilizar una hoja de bisturí desechable estéril para eliminar la mucosa intestinal del inserto de la membrana. El inserto de membrana se puede cortar, separándolo así del plástico. Tenga cuidado de no tocar nunca la muestra con el bisturí. El motivo para eliminar el inserto de membrana de las células incluidas en colágeno es que este filtro puede desprenderse en las fases posteriores de fijación o inclusión de parafina, lo que hace que las comparaciones entre modelos de mucosa intestinal sean desproporcionadas. Además, los insertos de membrana dentro de la sección incrustada tienen una consistencia diferente que puede interferir con el seccionamiento.</li>
	<li>Coloque los vasos de precipitados de 100 ml debajo de la campana de extracción química, cada uno correctamente etiquetado para incluir un sistema modelo de mucosa intestinal reconstruido que se está investigando. Añadir 25 ml de ETOH al 35% a cada vaso de precipitados y añadir la mucosa intestinal reconstruida. Incubar durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 35% con 25 mL de etanol al 50% e incube durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 50% con 25 ml de etanol al 70% e incube durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 70% con 25 ml de etanol al 80% e incube durante 10 minutos.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 80% con 25 ml de etanol al 95% e incube durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 95% con 25 mL de etanol al 100% e incube durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 100% con otro cambio de 25 ml de etanol al 100% e incube durante 10 min.</li>
	<li>Coloque vasos de precipitados de 100 ml debajo de la campana extractora, cada uno correctamente etiquetado para incluir un modelo bajo investigación. Agregue 50 ml de xileno o un agente aclarante histológico durante 10-20 min. NOTA: Se recomienda Histo-Clear (agente aclarante histológico) ya que el agente mejora la claridad y la vitalidad de las tinciones acidófilas. El tiempo de aclaramiento puede variar de una muestra de mucosa intestinal reconstruida a otra y debe comprobarse la transparencia de la apariencia cada 2-3 minutos.</li>
	<li>Tan pronto como las muestras estén transparentes, colóquelas en un soporte de casete de papel tisú de metal que luego se sumerge en parafina líquida dentro de la máquina calentada durante 45 minutos.</li>
	<li>Cambie la parafina y deje las muestras dentro de la máquina calentada durante 45 minutos más.</li>
	<li>Retire el soporte del casete de pañuelos y colóquelo sobre hielo para que se enfríe. Cuando los bloques de muestra enfriados se desprenden del soporte de metal, estos se pueden enfriar aún más a temperatura ambiente.</li>
	<li>Almacene los bloques en RT. NOTA: Si el objetivo es preparar secciones de inmediato, entonces los bloques se pueden colocar a 4 ° C para que se enfríen bien cuando se usen.</li>
	<li>Corta secciones de 4 μm con un micrótomo.</li>
	<li>Coloque las secciones cortadas en portaobjetos y séquelas en un horno a 37 ° C durante 24 h.</li>
	<li>Las diapositivas están listas para su uso. Guárdelos en RT hasta que se realice la tinción histológica de H&E o la tinción de reacción inmunohistoquímica (tipo antígeno-anticuerpo).<ol><li>Para la tinción inmunohistoquímica, seleccionar los anticuerpos de interés (ya sea para el estudio de proteínas TJ como la ocludina o para la activación, migración y diferenciación de monocitos) y detectar la expresión (mediante tinción) utilizando kits comerciales.</li>
		<li>Del mismo modo, mida la mucosidad con el kit de tinción de azul alcián y ácido peryódico-Schiff (PAS).</li>
		<li>Cuantificar las proteínas TJ teñidas de interés, como la ocludina, calculando el porcentaje de píxeles positivos en las micrografías tomadas del microscopio.</li>
		<li>Analice las imágenes de las células utilizando un software de análisis de imágenes (por ejemplo, el software ImageJ2 [Wayne Rasband, versión 2.9.0/1.53t]).<ol><li>Para realizar el análisis de los píxeles, procese las imágenes digitales a 300 píxeles/pulgada y conviértalas a 8 bits. A continuación, procesa las imágenes binarias mediante el plugin Color Deconvolution para analizar la tinción de la proteína de interés, en este caso, la tinción roja permanente de la ocludina.</li>
			<li>Guarde la imagen seleccionada como un tiff y sométala a un procedimiento de "limpieza" para eliminar artefactos con un editor de gráficos (por ejemplo, Adobe PhotoshopCC [versión 20.0.4]).</li>
			<li>A partir de entonces, mida todos los campos de interés con la aplicación Analyze Particle of ImageJ2 e informe de los datos como el número de píxeles. NOTA: Cada experimento debe realizarse por triplicado con tres campos de réplica internos analizados para cada réplica. Para cuantificar la mucosidad, se puede aplicar el mismo principio de medición de los píxeles a las imágenes tomadas de las mucinas neutras teñidas de púrpura magenta y de la mucina ácida teñida de azul brillante, respectivamente.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Construcción de un modelo 3D de mucosa intestinal con inclusión en parafina

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. 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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

El sistema modelo básico de mucosa intestinal reconstruida que se presenta aquí (Figura 6) combina la complejidad fisiológica (cultivos celulares 3D más relevantes desde el punto de vista fisiológico que contienen una monocapa de Caco-2 con un soporte de lámina propia rica en MEC que contiene fibroblastos y monocitos) con la simplicidad experimental (utilizando líneas celulares humanas comerciales para producir un sistema estandarizado y fácilmente repetible)13</sup...

La barrera epitelial intestinal, un revestimiento interno de una célula de espesor que contiene diferentes tipos de células epiteliales, constituye la primera barrera o interfaz defensiva física entre el medio externo e interno del cuerpo 1,2. Los enterocitos de tipo cilíndrico constituyen el tipo más abundante de células epiteliales. Estos son responsables de mantener la integridad de la barrera epitelial a través de las interacciones entre varios componentes de la barrera, incluidas las uniones estrechas (TJ), desempeñando un papel importante en el endurecimiento de la barrera 1,3. La estructura de la TJ consiste en proteínas de placa intracelular, como la zonula occludens (ZO) y la cingulina, que cooperan con las proteínas transmembrana, incluidas las ocludinas, las claudinas y las moléculas de adhesión de unión (JAM) que forman una estructura similar a una cremallera que une estrechamente a las células vecinas 3,4. Las proteínas transmembrana regulan la difusión paracelular pasiva de compuestos pequeños y excluyen las moléculas grandes tóxicas.
Los compuestos alimentarios potencialmente tóxicos y los contaminantes alimentarios estimulan la producción de citoquinas inflamatorias que alteran la permeabilidad epitelial, activando las células inmunitarias y causando inflamación crónica del tejido intestinal 5,6,7. Por el contrario, se ha informado que varios fitoquímicos antioxidantes y antiinflamatorios reducen la expresión de citocinas inflamatorias y mejoran la integridad de la barrera intestinal de TJ a través de la restauración de la expresión y el ensamblaje de la proteína TJ 4,6,8. Por lo tanto, la regulación de la integridad de la barrera epitelial por compuestos beneficiosos y dañinos ha visto un aumento en el uso de modelos in vivo e in vitro destinados a imitar la barrera intestinal para el cribado farmacéutico y los estudios de toxicidad. Esto es particularmente relevante dado el creciente interés en comprender la fisiopatología de las enfermedades intestinales intestinales (EII), la enterocolitis necrotizante y el cáncer, que pueden ser simuladas en modelos experimentales 8,9,10.
Ha habido una demanda para el desarrollo de modelos in vitro basados en células con el fin de lograr el objetivo de las "3R" en la experimentación con animales. Estos incluyen alternativas de reemplazo al uso de animales, reducción en el número de animales utilizados y refinamiento en la adopción de métodos que alivian la angustia 11,12,13. Además, los mecanismos moleculares, celulares y fisiológicos subyacentes entre los modelos humanos y murinos (siendo los roedores las especies más utilizadas) son distintivos, lo que lleva a la controversia sobre la eficacia de los modelos murinos como predictores en las respuestas humanas12,13. Entre las numerosas ventajas de los modelos in vitro de líneas celulares humanas se incluyen la experimentación restringida a objetivos, la observación directa y el análisis continuo13.
Las monocapas de tipo unicelular en cultivos bidimensionales (2D) han servido como modelos poderosos. Sin embargo, estos no pueden reproducir con precisión la complejidad fisiológica de los tejidos humanos 8,13,14. Como resultado, los sistemas de cultivo 3D se están desarrollando con mejoras cada vez mayores para recapitular la complejidad fisiológica de los tejidos intestinales sanos y enfermos como herramientas de evaluación de riesgos de próxima generación13,14. Estos modelos incluyen andamios 3D Transwell con diversas líneas celulares, cultivos de organoides y dispositivos microfluídicos (intestino en chip) que utilizan tanto líneas celulares como organoides (derivados de tejidos sanos y enfermos)8,13,14.
El protocolo 3D de "tejido sano" equivalente intestinal presentado en el presente estudio se basó en lograr un equilibrio entre la complejidad fisiológica y la simplicidad experimental13. El modelo es representativo de un andamio 3D de Transwell, compuesto por tres líneas celulares (enterocitos [la línea Caco-2 del adenocarcinoma de colon de referencia] con un componente inmune de soporte [monocitos U937 y fibroblastos L929]), constituyendo un sistema estandarizado y fácilmente repetible aplicable para el cribado preliminar de moléculas dietéticas de interés sobre la integridad de la barrera epitelial intestinal y la respuesta inmunitaria. El protocolo incluye la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de la luz de la integridad de la barrera epitelial utilizando equivalentes intestinales fijos. La ventaja del enfoque actual es que se pueden teñir numerosas secciones de los tejidos incrustados para múltiples parámetros a partir de un solo experimento.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

Ha aumentado el uso de modelos intestinales in vivo e in vitro para estudiar la fisiopatología de las enfermedades inflamatorias intestinales, para el cribado farmacológico de sustancias potencialmente beneficiosas y para los estudios de toxicidad de componentes alimentarios potencialmente nocivos. Cabe destacar que existe una demanda actual para el desarrollo de modelos in vitro basados en células que sustituyan a los modelos animales. Aquí, se presenta un protocolo para un modelo básico de equivalente intestinal tridimensional (3D) de "tejido sano" utilizando líneas celulares con el doble beneficio de proporcionar simplicidad experimental (sistema estandarizado y fácilmente repetible) y complejidad fisiológica (enterocitos Caco-2 con un componente inmune de soporte de monocitos U937 y fibroblastos L929). El protocolo también incluye la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de luz de equivalentes intestinales fijos, lo que proporciona la ventaja de analizar múltiples parámetros visuales a partir de un solo experimento. Para verificar la eficacia del modelo como sistema experimental se utilizan cortes teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) que muestran las células cilíndricas de Caco-2 formando una monocapa apretada y regular en tratamientos de control. Utilizando el gluten como componente alimentario proinflamatorio, los parámetros analizados en las secciones incluyen la reducción del grosor de la monocapa, así como la disrupción y el desprendimiento de la matriz subyacente (H&E), la disminución de la expresión de la proteína de unión estrecha como se muestra en la tinción de ocludina (cuantificable estadísticamente) y la activación inmune de las células U937 migratorias como se evidencia en la tinción del grupo de diferenciación 14 (CD14) y la diferenciación relacionada con CD11b en macrófagos. Como se muestra mediante el uso de lipopolisacáridos para simular la inflamación intestinal, los parámetros adicionales que se pueden medir son el aumento de la tinción de moco y la expresión de citocinas (como la midquina) que se pueden extraer del medio antes de la fijación. El modelo básico tridimensional (3D) de la mucosa intestinal y las secciones fijas pueden recomendarse para estudios de estado inflamatorio e integridad de la barrera con la posibilidad de analizar múltiples parámetros visuales cuantificables.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Autor destacado: Investigación de los efectos de los compuestos en el tejido intestinal utilizando modelos de líneas celulares humanas en 3D 

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

El primer aspecto importante es determinar la aceptabilidad de la mucosa intestinal equivalente básica en 3D con fines experimentales. Esto se realiza con la tinción más utilizada en los laboratorios de histología e histopatología, a saber, la hematoxilina (tiñe el material nuclear de color azul-púrpura intenso) y la eosina (tiñe el material citoplasmático de diferentes tonos de rosa). La tinción H&E se realiza primero en un control no tratado, que se cultiva en las mismas condiciones y plazos que los tratamien...

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Aquí describimos la construcción de un sistema modelo básico tridimensional (3D) de líneas celulares intestinales y un protocolo de inclusión de parafina para la evaluación microscópica óptica de equivalentes intestinales fijos. La tinción de proteínas seleccionadas permite el análisis de múltiples parámetros visuales de un solo experimento para su uso potencial en estudios preclínicos de detección de fármacos.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

El objetivo del trabajo es utilizar estos modelos de líneas celulares humanas tridimensionales in vitro para investigar el hecho de compuestos beneficiosos y útiles en el tejido intestinal. Los modelos se pueden utilizar para ampliar la comprensión de la investigación y también como modelo básico de fármacos. Utilizando los compuestos derivados de plantas, espermidina y eugenol, tanto por separado como juntos en forma de suplemento, medimos los aumentos beneficiosos de la autofagia y la disminución de la inflamación utilizando estos modelos.Entonces también podremos mostrar el efecto potencialmente dañino del gluten extraído de ciertas variedades de trigo sobre los tejidos intestinales. Actualmente estamos utilizando sistemas in vitro de precio económico, estandarizados y fácilmente repetibles que reflejan mejor la fisiología del intestino humano como alternativa a los modelos animales. Dado que también utilizamos líneas celulares humanas comerciales en lugar de células derivadas de plantas, las respuestas del estudio son más aplicables a la población general.El protocolo se basa enteramente en el uso de diferentes líneas. Esto hace que el modelo sea más estandarizado y reproducible. Además, el cultivo simultáneo de diferentes líneas celulares, enterocitos, fibroblastos y células del sistema inmune, permite respuestas celulares más cercanas a lo que sucede en el paciente.

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Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

718 vistas.  Alma Mater Studiorum-University of Bologna. El objetivo del trabajo es utilizar estos modelos de líneas celulares humanas tridimensionales in vitro para investigar el hecho de compuestos beneficiosos y útiles en el tejido intestinal. Los modelos se pueden utilizar para ampliar la comprensión de la investigación y también como modelo básico de fármacos. Utilizando los compuestos derivados de plantas, espermidina y eugenol, tanto por separado como juntos en forma de suplemento, medimos los aumentos beneficiosos de la autofagia y l...

Video: Autor destacado: Investigación de los efectos de los compuestos en el tejido intestinal utilizando modelos de líneas celulares humanas en 3D 

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Investigación

Biología

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Preparación de un modelo básico de mucosa intestinal reconstruida en 3D para la evaluación microscópica de equivalentes intestinales fijos

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.