Para la inclusión de células en parafina, ajuste la máquina de parafina a 58 grados centígrados. Con unos alicates, transfiera los insertos de la membrana a los pocillos limpios de una placa estéril de 24 pocillos. Agregue 500 microlitros de formalina tamponada al 37% y PBS por encima del filtro y un mililitro por debajo del filtro.
Cierre la tapa y deje la placa en una campana extractora durante dos horas. Una vez que la lámina propia se haya desprendido del inserto de la membrana, transfiera la mucosa intestinal a un vaso de precipitados que contenga 25 mililitros de etanol al 35% e incube durante 10 minutos. Después de la deshidratación en concentraciones crecientes de etanol, coloque las muestras en 50 mililitros de xileno o un agente aclarante histológico durante 10 a 20 minutos.
Una vez que las muestras estén transparentes, colóquelas en un soporte de casete de papel tisú de metal y sumérjalas en parafina líquida dentro de una máquina calentada. Después de 45 minutos, use un micrótomo para cortar secciones de cuatro micras. Coloque la sección cortada en los portaobjetos y séquelos en un horno a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Un modelo aceptable de mucosa intestinal equivalente en 3D consiste en células Caco-2 formadas en una monocapa apretada y regular por encima de la lámina propia rica en matriz extracelular. Los modelos inaceptables incluyen aquellos que muestran un crecimiento excesivo, capas epiteliales desorganizadas, malformación o falta de formación de capas epiteliales. El efecto proinflamatorio de la proteína de trigo con un alto contenido de gluten alteró la monocapa celular y redujo el grosor de la capa epitelial en comparación con el grupo control.
El contenido de proteína ocludina fue significativamente mayor en el grupo control que en el grupo expuesto a la proteína gluten. La tinción de CD14 y CD11b de monocitos U937 mostró que la proteína de trigo con un alto contenido de gluten activó los monocitos e indujo su migración y diferenciación en macrófagos. Bajo el desafío de lipopolisacáridos, las células Caco-2 aumentaron la producción de moco y la liberación del marcador inflamatorio midquina.
