Para empezar, siembre un volumen de 200 microlitros de 10.000 células de carcinoma hepatocelular en una placa de 96 pocillos con DMEM y 10% de FBS. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo y trate las células con concentraciones variables de peróxido de hidrógeno y menadiona.
Disuelve cinco miligramos de DHE en un mililitro de DMSO. Para la solución de trabajo, diluir una alícuota de 100 micromoles con medios DMEM precalentados hasta una concentración de 10 micromoles. Agite la solución de tinte de trabajo durante 5 a 10 segundos para garantizar una mezcla adecuada.
Ahora retire el medio de prueba de cada pocillo antes de colocar las células de carcinoma. A continuación, lave suavemente cada pocillo con PBS. Pipetear 100 microlitros de la solución de colorante de trabajo en cada pocillo.
Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Retire el medio que contiene DHE de cada pocillo. Utilice una pipeta multicanal para lavar cada pocillo tres veces con PBS.
Ahora, pipetee 200 microlitros de PBS que contienen el colorante de tinción nuclear Hoechst 33342 en cada pocillo. Después de la incubación, transfiera la placa a una plataforma de cribado de alto contenido. Inicie el software de cribado de alto contenido Cellomics CX7.
Calibre la plataforma de imágenes según las especificaciones del fabricante. Abra los parámetros del sistema específicos de la marca de la placa en la base de datos de instrumentos. A continuación, coloque con cuidado la placa con las muestras en la platina calentada del sistema de imágenes.
Asegúrese de que la placa esté bien colocada y en la orientación correcta. A continuación, presione suavemente la microplaca para asegurarse de que queda plana contra la platina. Una vez que la placa esté colocada correctamente, mantenga presionada la tecla Control.
A continuación, haga clic en Control y Aceptar para abrir el cuadro de diálogo Carga/Descarga de placas. Para seleccionar los parámetros de imagen, abra el modo de activación de objetivos en la interfaz de Cellomics BioApplications. Crear un nuevo protocolo para la adquisición de datos de doble canal compatible con la tinción nuclear y la sonda de fluorescencia DHE.
A continuación, especifique los objetivos necesarios para la adquisición de imágenes y, a continuación, elija el aumento adecuado. Ahora especifique el tiempo de exposición, la flexión de la cámara y el intervalo de pila z. Una vez establecidos los parámetros de imagen, identifique el objeto de seguimiento primario de interés utilizando los diferentes algoritmos del instrumento.
Después de segmentar el objeto identificado, valide el objeto principal en función de los parámetros específicos de tamaño, forma e intensidad únicos para cada tipo de célula. Defina la región de interés alrededor del objeto y establezca un círculo de 20 micrómetros a su alrededor. Haga clic en la pestaña Caracterización de la población y, a continuación, establezca el límite de escaneo en 1000 celdas por pocillo con un mínimo de 10 objetos por campo.
Ahora haga clic en Vista de inicio para escanear cada placa de pocillo. A continuación, inicie el software de análisis de vistas y exporte los parámetros de datos cuantitativos en formato CSV para un análisis adicional. La exposición al peróxido dio lugar a un incremento estadísticamente significativo de la fluorescencia inducida por ROS en todas las líneas celulares de forma dependiente de la dosis.
Con la menadiona, las células JHH-4 mostraron un incremento dependiente de la dosis en la intensidad fluorescente. Sin embargo, la diferencia significativa en la fluorescencia se observó solo a concentraciones más altas en las otras dos líneas celulares.
