Para comenzar, coloque las semillas de Brassica napus DH12075 en microtubos. Para desengrasar las semillas, añadir agua y detergente al 0,1% al microtubo, y agitar durante 60 segundos. Ahora enjuague las semillas con agua seguida de etanol al 70%, cada una durante 60 segundos.
A continuación, coloque las semillas en una solución de hipoclorito de sodio al 10% y agite durante 20 minutos. Después de quitar la lejía, lave las semillas cuatro veces con agua estéril durante 60 segundos cada una. Coloque las semillas en una placa de Petri que contenga el medio de germinación de semillas.
Estratificar en frío las semillas a cuatro grados centígrados durante la noche antes de trasladar el plato a una sala de cultivo. Después de cinco días, transfiera las plántulas a una caja de cultivo de plantas que contenga un medio de crecimiento de plantas. Inocular Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 portador de un plásmido inductor de raíces pilosas PRIA 4B en cinco mililitros de medio LB.
Cultive el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados hasta que alcance una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,9 a uno. Transfiera el inóculo bacteriano a la jeringa. Con una aguja de calibre 26 montada en la jeringa, perfore el hipocótilo de una plántula de 18 días de edad a aproximadamente un centímetro por encima del medio de crecimiento.
Inyecte aproximadamente 50 microlitros de inóculo en la herida y rasque el tejido en la superficie del hipocótilo. Regrese la planta a la sala de cultivo a 21 grados centígrados durante dos a cuatro semanas. A continuación, corte el callo con raíces pilosas emergidas del hipocótilo.
Coloque el callo con raíces pilosas en una placa de Petri que contenga medio de crecimiento de raíces pilosas y antibióticos para suprimir el crecimiento de agrobacterias. Selle el plato con cinta adhesiva permeable al gas antes de incubarlo a 24 grados centígrados. Después de la incubación, aísle las raíces pilosas del callo y transfiera las raíces individuales a un medio de crecimiento de raíces pilosas.
Alternativamente, para generar una planta compuesta que consista en brotes de tipo silvestre y raíces peludas transgénicas, elimine las raíces nativas de la planta. Luego, transfiera la planta con raíces peludas emergentes a una caja de cultivo que contenga medio de crecimiento vegetal y antibióticos para suprimir el crecimiento de agrobacterias.
