Agradecemos a Jiří Macas (Centro de Biología CAS, České Budějovice, República Checa) por proporcionar la cepa agrobacteriana. El Core Facility Plants Sciences de CEITEC MU es reconocido por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa con el Proyecto del Fondo Europeo de Desarrollo Regional "SINGING PLANT" (no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) y el proyecto INTER-COST LTC20004.

Inducción y regeneración de raíces pilosas mediadas por agrobacterias en plantas

<ol>
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I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo sin ninguna relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Desarrollamos un protocolo simple para la transformación de la raíz pilosa y su posterior regeneración en B. napus y A. thaliana. Este proceso incluye la inducción de raíces pilosas a base de inyección en el hipocótilo (B. napus) o en el tallo primario de la inflorescencia (A. thaliana). El método de inyección del hipocótilo con la cepa agrobacteriana C58C1 portadora de un plásmido Ri también fue efectivo en la familia Fabaceae10,11, además de los miembros de Brassicaceae presentados en este estudio.
Una alternativa al método basado en inyección es la transformación basada en inmersión que consiste en la inmersión del explante en una suspensión bacteriana, seguida del cocultivo del explante con agrobacterias. La ventaja del método basado en inyección sobre el método de inmersión es el tiempo ahorrado por la ausencia de algunos pasos del protocolo: preparación del explante, prueba del tiempo de cocultivo y cultivo en un medio que contiene hormonas para la inducción de raíces pilosas. A pesar de que ambos abordajes son efectivos para la inducción de raíces pilosas, se observó una mayor eficiencia de transformación en algunas especies con el método basado en inyección en comparación con el método de inmersión en explantes12,13. Además, la transformación basada en inyección también es útil para generar plantas compuestas (raíces peludas transgénicas y brotes de tipo silvestre). Después de cortar las raíces originales de la planta transformada, las raíces peludas apoyan el crecimiento de la planta y el transgén se puede estudiar en el contexto de toda la planta.
El paso crítico de la inducción de la raíz pilosa es inyectar el inóculo en el hipocótilo o tallo de la inflorescencia primaria. Los hipocótilos de B. napus son frágiles, y cortar todo el hipocótilo puede suceder fácilmente. Lo mismo se puede observar con A. thaliana debido a la delgadez del tallo de la inflorescencia. Si se requiere una comparación de la eficiencia de transformación de diferentes especies/cultivares, recomendamos que una persona realice todos los experimentos para evitar el error causado por la manipulación y la habilidad en la inyección de las plantas.
Desarrollamos un protocolo efectivo para la regeneración de raíces pilosas en B. napus DH12075 y A. thaliana Col-0. Como la regeneración es un proceso muy variable, se pueden aplicar algunas modificaciones al protocolo a una especie o cultivar de elección. Por ejemplo, los brotes peludos derivados de la raíz pueden ser provocados por una relación diferente de auxina/citoquinina (1:1) en B. oleracea14. Alternativamente, se puede utilizar citoquinina tidiazurón en lugar de BAP, como en el caso de las raíces pilosas de B. campestris 15.
Las múltiples inserciones del ADN T del plásmido Ri en el genoma de la planta representan una limitación potencial del sistema de transformación y regeneración de la raíz pilosa. En tales casos, no se descubren plantas libres de TL/TR del plásmido Ri después de un análisis de segregación de plántulas T1. Por lo tanto, recomendamos generar varias líneas de raíces pilosas independientes para cada transgén.
Los cultivos de raíces pilosas son una herramienta extremadamente poderosa para los estudios funcionales de genes, principalmente debido a su rápido establecimiento y mantenimiento barato (no se necesitan hormonas en los medios de cultivo). Este protocolo cubre los métodos para la inducción y regeneración de raíces pilosas en B. napus y A. thaliana, que se pueden utilizar para estudiar el transgén de interés directamente en cultivos de raíces pilosas, en el contexto de toda la planta utilizando plantas compuestas, o después de la regeneración de las plantas transgénicas.

La transformación de las plantas es el cuello de botella de cualquier estudio genético en biología vegetal. Una bacteria transmitida por el suelo, Agrobacterium tumefaciens, se usa ampliamente como medio para la entrega de genes por inmersión floral o cultivo de tejidos para generar transformantes. A. tumefaciens infecta a las plantas en el sitio de la herida y causa tumores debido a la transferencia e integración de ADN-T de un plásmido inductor de tumores (Ti) en el genoma de la planta huésped. Las cepas modificadas de A. tumefaciens con plásmido de Ti modificado sin el ADN-T de tipo salvaje y un vector binario con ADN-T artificial y sitios de clonación para insertar un gen de interés se utilizan comúnmente como un sistema eficiente de transformación de plantas1. Sin embargo, muchas especies y cultivos modelo son recalcitrantes a la inmersión floral o a la regeneración in vitro de las plantas o tienen ciclos de crecimiento largos, lo que afecta la eficiencia de este sistema de transformación.
Agrobacterium rhizogenes induce la formación de raíces adventicias, o raíces peludas, en el sitio de la herida después de infectar una planta huésped. Al igual que A. tumefaciens, A. rhizogenes transfiere un ADN-T de un plásmido inductor de raíces (Ri) al genoma de la planta huésped, lo que provoca el desarrollo de raíces pilosas transgénicas. Este proceso está controlado principalmente por los genes de los loci oncogénicos de la raíz (rol) 2,3. Utilizando cepas agrobacterianas portadoras tanto del plásmido Ri como de un vector binario artificial que codifica un gen de interés, se han utilizado cultivos de raíces pilosas para producir proteínas recombinantes, analizar la función de promotores o genes, o editar genomas utilizando repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9)4,5,6.
Nuestro protocolo utiliza la cepa transconjugante Ti-less A. tumefaciens C58C1 portadora del plásmido Ri pRiA4b7. El ADN-T del plásmido Ri consta de dos regiones, ADN-T derecho e izquierdo (ADN-TR y ADN-TL, respectivamente), que pueden integrarse de forma independiente en el genoma de la planta8. Aprovechando este sistema,se optimizó el largo proceso de transformación del explante en el cultivar Brassica napus DH12075 9. El protocolo que se detalla a continuación permite la regeneración de líneas de raíces pilosas seleccionadas y la obtención de plantas T1 portadoras del transgén de interés y libres de genes rol, en aproximadamente 1 año. La transformación de raíz pilosa basada en inyección se puede utilizar en otras especies de Brassicaceae, como se muestra mediante la transformación de Arabidopsis thaliana Col-0. Mientras que el hipocótilo se usa para transformar B. napus, A. thaliana se inyecta en el tallo primario de la inflorescencia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

La transformación de raíces pilosas representa una herramienta versátil para la biotecnología vegetal en diversas especies. La infección por una cepa de Agrobacterium portadora de un plásmido inductor de raíces (Ri) induce la formación de raíces pilosas en el sitio de la herida después de la transferencia de ADN-T del plásmido Ri al genoma de la planta. El protocolo describe en detalle el procedimiento de inducción de la raíz pilosa a base de inyección en Brassica napus DH12075 y Arabidopsis thaliana Col-0. Las raíces pilosas pueden ser utilizadas para analizar un transgén de interés o procesadas para la generación de plantas transgénicas. El medio de regeneración que contiene citoquinina 6-bencilaminopurina (5 mg/L) y auxina 1-naftalenacético (8 mg/L) provoca con éxito la formación de brotes en ambas especies. El protocolo abarca el genotipado y selección de plantas regenerantes y T1 para la obtención de plantas portadoras de un transgén de interés y libres de ADN-T del plásmido Ri . También se representa un proceso alternativo que conduce a la formación de una planta compuesta. En este caso, las raíces pilosas se mantienen en el brote (en lugar de las raíces naturales), lo que permite el estudio de un transgén en cultivos de raíces pilosas en el contexto de toda la planta.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Autor destacado: Optimización de los protocolos de transformación basados en raíces peludas para mejorar la eficiencia en Brassicaceae

Transformación y regeneración de raíces pilosas en Arabidopsis thaliana y Brassica napus

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

Previamente hemos optimizado un protocolo para la inducción de raíces pilosas por inyección en tres cultivares de Brassica napus, a saber, DH12075, Topas DH4079 y Westar9. Para aplicar este protocolo de transformación a la especie modelo A. thaliana, se inyectó un inóculo agrobacteriano a los tallos primarios de la inflorescencia de plántulas de 1 mes de edad. Las raíces pilosas emergieron en el sitio de la inyección después de 2-4 semanas. Las raíces pilosas se extirparon y se cultivaron en el medio sólido. La comparación del método en estas dos especies se muestra en la Figura 1.
Las líneas de raíces pilosas seleccionadas se transfirieron al medio de regeneración para inducir la formación de brotes. En A. thaliana, se indujeron callos amarillos en un plazo de 14 días en las 10 líneas de raíces pilosas probadas. Los primeros primordios del brote, visibles como manchas de color verde oscuro, emergieron dentro de las 3 semanas posteriores a la transferencia al medio de regeneración (Figura 2). Después de 4 semanas de cultivo, los brotes cubrieron las raíces pilosas en 9 de las 10 líneas de raíces pilosas (90% de eficiencia de regeneración). En algunos casos, las raíces adventicias se obtuvieron del callo (Figura 2H). Una línea no se regeneró incluso después de 3 meses en el medio de regeneración (cada 4 semanas, las raíces pilosas se transfirieron a un medio fresco). Por lo tanto, la eficiencia de regeneración de las raíces pilosas de A. thaliana se asemeja a la eficiencia de B. napus DH120759.
Los regenerantes de raíces peludas de B. napus y A. thaliana muestran un fenotipo enano (Figura 3), una característica típica de las plantas derivadas de raíces peludas2. También observamos sistemas radiculares densos, hojas arrugadas y cambios en el tiempo de floración. Este fenotipo llamado raíz pilosa (o Ri) es causado por los genes de rol del plásmido Ri insertados en el genoma de la planta. La inserción del ADN-T Ri y el transgén codificado en un vector binario pueden ser independientes o estar ligados. Por lo tanto, un análisis de segregación de la progenie T1 creada por autopolinización ayuda a identificar plantas libres de rollos que expresan el transgén de interés. El genotipado de las plantas T1 se realiza mediante cebadores de PCR específicos para los ORFs de TL y TR y el transgén de interés. La ausencia de contaminación agrobacteriana se verifica por la ausencia de productos de PCR de los cebadores virC (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> Figura 1: Resumen del procedimiento en A. thaliana y B. napus. La inyección del inóculo de Agrobacterium en el tallo del hipocótilo o inflorescencia primaria induce el desarrollo de raíces pilosas. Las raíces peludas pueden reemplazar a las raíces nativas para generar una planta compuesta que será genotipada y analizada (flechas azules). Las raíces pilosas cultivadas pueden regenerarse en plantas T0, propagarse en plantas T1 y genotiparse (flechas verdes). Las raíces pilosas también se pueden subcultivar para el análisis funcional (flecha negra). Se presentan ejemplos de resultados de genotipado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> Figura 2: Regeneración de raíces pilosas en A. thaliana. (A) Cultivo de raíces pilosas 1 día después de su transferencia a placas. (B, C) Calli se desarrolló dentro de las 2 semanas posteriores al cultivo en medio de regeneración. (D, E) Los primordios de los brotes emergieron después de 3 semanas de cultivo. (G, H) Los brotes se forman después de 4 semanas. (H) Las raíces adventicias se desarrollaron a partir del callo. (C, F, I) Línea radicular pilosa no regeneradora. Las barras de escala representan 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> Figura 3: Fotos representativas de plantas silvestres de B. napus y A. thaliana y regenerantes derivados de raíces peludas (plantas T0). Obsérvese el fenotipo Ri de los regenerantes. Las barras de escala representan 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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El protocolo describe la inducción de raíces pilosas utilizando tallos de inflorescencia primaria de Arabidopsis e hipocótilos de Brassica napus . Las raíces peludas pueden ser cultivadas y utilizadas como explantes para regenerar plantas transgénicas.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Nuestra investigación tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para una transformación eficiente en Brassicaceae. Utilizando una transformación basada en la raíz del cabello, mejoramos drásticamente la eficiencia de la transformación en Brassica napus, que es crucial para nuestra investigación. También probamos el protocolo en la especie modelo Arabidopsis thaliana.Hemos optimizado el protocolo para cultivares de primavera DH12075 en Brassica napus. El siguiente reto es optimizar el protocolo de transformación y regeneración de cultivares de invierno en Brassica napus, así como para Brassica rapa y Brassica oleracea. Las raíces pilosas se pueden propagar fácilmente, y su rápido crecimiento permite el análisis rápido del gen de interés poco después de la transformación.En consecuencia, es factible regenerar selectivamente líneas de raíces pilosas específicas que exhiben el rasgo deseado. Por ejemplo, una mutación genética introducida por CRISPR-Cas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.0K vistas.  Masaryk University. Nuestra investigación tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para una transformación eficiente en Brassicaceae. Utilizando una transformación basada en la raíz del cabello, mejoramos drásticamente la eficiencia de la transformación en Brassica napus, que es crucial para nuestra investigación. También probamos el protocolo en la especie modelo Arabidopsis thaliana.Hemos optimizado el protocolo para cultivares de primavera DH12075 en Brassica napus. El siguiente reto es opti...

Video: Autor destacado: Optimización de los protocolos de transformación basados en raíces peludas para mejorar la eficiencia en Brassicaceae

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Investigación

Biología

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

Transformación de la raíz pilosa mediada por agrobacterias en Brassica napus DH12075

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

Métodos de regeneración y selección de Brassica napus DH12075 regenerantes y plantas T1

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.