Para empezar, recoge el embrión de pez cebra y críalo hasta 72 horas después de la fecundación en una incubadora a 28,5 grados centígrados. Prepare simultáneamente los productos químicos que se van a probar a la concentración deseada. Examine los embriones de 72 horas después de la fertilización.
Retire los embriones muertos o sin eclosionar. Colocar 10 embriones en cada placa de cultivo de tejidos de seis centímetros con nueve mililitros de medio E3. Estas se llaman placas de exposición.
Etiquete cada placa de exposición con el nombre del compuesto, la concentración de exposición y el número de réplica. Agregue un mililitro de solución de exposición a cada placa, comenzando con la concentración más baja y agite suavemente la placa. Para compuestos con baja solubilidad, reemplace los 10 mililitros completos del medio con la solución de exposición.
Registre la secuencia en la que se agregaron las soluciones compuestas a los embriones, luego incube las placas en la cámara humidificada dentro de una incubadora a 28,5 grados centígrados durante 48 horas. Para comenzar el ensayo de sobresalto por vibración, encienda la computadora y el dispositivo de vibración. Cree una hoja de cálculo para el archivo de configuración.
Incluya información de exposición para cada una de las cinco posiciones de la placa, especificando el compuesto, la concentración y la réplica. Abra la interfaz de usuario general, o el programa GUI, para el kit de ensayo de sobresalto por vibración. Seleccione diferentes posiciones en el programa GUI para comprobar el movimiento de la cámara y observar la respuesta de la cámara.
Retire la placa de muestra de la incubadora. Colócalos en las cinco posiciones designadas y deja que los embriones se asienten durante varios minutos. En el programa GUI, haga clic en grabar y aparecerá la nueva ventana.
En esta ventana, seleccione el archivo de configuración preparado anteriormente. Compruebe que la descripción de la muestra coincida con las muestras de cada posición. Observe cómo se enciende el LED cuando el programa activa el pulso de sonido.
Después de grabar, la cámara volverá a la posición uno y el software comenzará a comprimir los archivos. Reemplace las muestras medidas con el siguiente conjunto y continúe con la siguiente ejecución como se demuestra. A continuación, recoja las soluciones de exposición de todas las placas medidas, utilizando un tamiz para retener simultáneamente los embriones.
Para iniciar el análisis de datos, abra los datos de video con doblaje virtual u otro software de visualización. Puntúa visualmente el número de embriones que responden al pulso de sonido. Registre el nombre del compuesto, la réplica, la concentración del compuesto y el porcentaje de embriones móviles en la hoja de cálculo.
Realice el análisis de concentración de referencia mediante un flujo de trabajo KNIME con scripts de R integrados. Una evaluación de la inmotilidad en embriones de tipo salvaje no tratados mostró una inmotilidad media del 14,33% cuando se sometieron a estímulos vibratorios, con variaciones entre las diferentes nidadas. Los cálculos de la concentración de referencia para los efectos de la tricaína sobre la motilidad mostraron una reducción de la motilidad a una concentración del 1%, cesando la actividad por encima del 2,5% con una concentración de referencia de 50 de 164,9 micromolares.
Un ejemplo de ensayo subóptimo mostró inconsistencias en las respuestas embrionarias, lo que implica problemas de desarrollo que afectan la robustez de la respuesta de sobresalto.
