Procedimiento de citometría de flujo para medir el pH relativo del glucosoma en Trypanosoma brucei vivo

Para comenzar, inicie el software del citómetro de flujo. Abra un nuevo experimento. Agregue el número deseado de muestras y asígneles un nombre.

A continuación, configure un histograma de canal YL2-H o RL1-H, un diagrama de puntos de área de dispersión directa frente a área de dispersión lateral, un diagrama de puntos de área de dispersión directa frente a altura de dispersión directa y un diagrama de puntos de canal BL1-H frente a VL2-H. Coloque las células de control de Trypanosoma brucei de tipo salvaje sin teñir en el puerto de inyección de la muestra y ajuste la posición de la platina. Para reducir el tamaño del archivo, desmarque los canales que no están destinados a grabarse.

Comience con un caudal bajo para permitir ajustes. A continuación, haga clic en Ejecutar para comenzar la adquisición de datos. Ajuste con precisión el voltaje YL2 o RL1 para alinear el pico principal dentro de 10 a la tercera a 10 a la cuarta unidad de intensidad de fluorescencia relativa.

Ajuste los voltajes de dispersión directa y dispersión lateral para garantizar que más del 90% de los eventos estén dentro del rango del diagrama de puntos. Establezca el umbral de dispersión directa para excluir los residuos sin omitir las células viables. Modifique la configuración de los canales VL 2 y BL 1 para colocar el pico primario del control de tipo salvaje sin teñir dentro de 10 a las dos a 10 a la cuarta unidad de intensidad de fluorescencia relativa.

Haga clic en Registrar y medir al menos 10.000 eventos. A continuación, coloque la primera muestra de Trypanosoma inducido que exprese pHluorin teñida con yoduro de propidio o rojo tiazol en el puerto de inyección de la muestra. Nuevamente, inicie la adquisición de datos a un caudal bajo después de realizar el enjuague.

Supervise cada gráfico para asegurarse de que más del 90% de los eventos se capturan correctamente y que los canales VL2-H y BL1-H no están saturados. Guarde los datos de cada muestra en formato de archivo FCS y prepárese para el análisis.