Para comenzar, realice una citometría de flujo en células de Trypanosoma brucei que expresan flúor. Abra un nuevo diseño y arrastre y suelte los archivos FCS adquiridos en la ventana de diseño. Para controlar células vivas, seleccione el control de tipo salvaje sin teñir para abrir una ventana.
Analice los datos mediante histogramas en el canal YL2H o RL2H. En este caso, utilice un histograma YL2H, ya que las muestras se tiñeron con yoduro de propidio. A continuación, establezca una puerta bisectriz para separar las células vivas de las muertas, etiquetando la puerta izquierda como viva y la puerta derecha como muerta.
Aplique y ajuste esta puerta en todas las muestras. Asegúrese de que la puerta se dibuja correctamente visualizando la puerta en varias muestras del conjunto de datos. En el control de tipo salvaje sin manchar, haga doble clic en la puerta activa.
Establezca el eje X del diagrama de puntos en el área de dispersión hacia adelante y el eje Y en el área de dispersión lateral. A continuación, utilice la herramienta Puerta de polígono para delinear la población de celdas, etiquetándola como celdas. Excluya los escombros o las células y agregados moribundos teniendo cuidado con sus posiciones típicas en el diagrama de puntos.
Aplique la puerta de células debajo de la puerta viva para todas las muestras, asegurándose de que cubra la población de células probable para todas las muestras. Haga doble clic en la puerta de celdas en el control de tipo salvaje sin teñir para ver los eventos dentro de esta puerta. Para ajustar el diagrama de puntos, establezca el eje X en el área de dispersión hacia delante y el eje Y en la altura de dispersión hacia delante.
Identifique la distribución diagonal de las celdas individuales en este diagrama de puntos, distinguiéndolas de los dobletes. Utilice la herramienta Puerta de polígono para rodear los eventos singlet, nombrando a esta puerta singlets. Aplique la compuerta de singletes debajo de la compuerta de celdas para todas las muestras, asegurándose de que excluya los dobletes e incluya singletes, y ajuste la compuerta según sea necesario en diferentes muestras.
En la muestra de control de tipo salvaje sin teñir, haga doble clic en la puerta singletes. Modifique el eje X del diagrama de puntos a BL1H y el eje Y a VL2H. Con la herramienta Puerta poligonal, dibuje una puerta diagonal para capturar células fluorescentes de flúor-2 en VL2 y BL1.
Etiquete esta puerta como pHL positiva. Aplique la compuerta positiva de pHL debajo de la compuerta singlete para todas las muestras. Ajuste la puerta pHL para cubrir las células con una intensidad de fluorescencia más alta que las células autofluorescentes en el control de tipo salvaje.
Para exportar las estadísticas, haga clic en el editor de tablas, luego en la barra de edición y, finalmente, seleccione agregar columna. Incorpore columnas para el recuento total no contaminado, el recuento de pHL positivo, la frecuencia en vivo del total, la frecuencia positiva de pHl del padre, la mediana de pHL positiva VL2H y la mediana de pHL positiva BL1H. Para ajustar la configuración de exportación en el editor de tablas, establezca display en archivo y texto en CSV.
Seleccione el destino y el nombre del archivo y, a continuación, haga clic en crear tabla. Se observó una acidificación leve gradual a lo largo del tiempo en respuesta a la inanición, que se estabilizó a los 90 minutos. Después de reintroducir la glucosa como lo indica la línea verde, el pH glusómico volvió a los niveles de prestarvación en 30 minutos, lo que sugiere que el pH glusómico es dinámico y regulable en respuesta a la glucosa.
