Para empezar, tome cultivos de 12 días de células madre pluripotentes humanas que hayan sido sometidas a la inducción de la cresta neural. Aspire suavemente el medio C de las células. Agregue 100 microlitros de PBS por centímetro cuadrado de área de superficie del pocillo para lavar las celdas y luego retire el PBS.
Agregue un volumen igual de solución de desprendimiento celular a las células e incube durante 30 minutos bajo una suplementación de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Agregue un volumen igual de medio NCC en la placa. A continuación, utilice una pipeta serológica para recolectar la suspensión celular y transferirla a un tubo cónico de 15 mililitros.
Gira las celdas a 290 g durante dos minutos entre 20 y 25 grados centígrados. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletización de la celda. Utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para pipetear 12 mililitros de medio NCC en el pellet de la célula.
Pipetea mecánicamente la suspensión hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión. Luego, transfiera la suspensión de celdas a una placa de fijación ultra baja. El día 14, agite suavemente las placas de cultivo celular para recoger pequeños esferoides en el centro de cada pocillo.
Utilice una micropipeta P1000 para aspirar lentamente el medio gastado de la circunferencia de cada pocillo. Vuelva a alimentar las celdas con el volumen original de medio NCC. El día 15, retire con cuidado el medio.
Agregue PBS a los pocillos para lavar los esferoides. Luego, elimine la mayor cantidad posible de PBS, asegurándose de que los esferoides no se alteren. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de desprendimiento de celda por centímetro cuadrado de área de superficie del pozo.
Incubar las células en la solución durante 30 minutos bajo un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Con una pipeta serológica de 10 mililitros, agregue un volumen igual de medio ENC a cada pocillo. Pipetear mecánicamente la solución para romper los esferoides restantes.
Luego transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros. Deseche el sobrenadante después de centrifugar como antes. Luego, vuelva a suspender las células en 5 a 10 mililitros de medio ENC.
Cuente la concentración de células viables usando azul de tripán y hemocitómetro. Ahora, agregue suficiente volumen de medio ENC para cubrir alrededor de 300,000 a 400,000 células viables por centímetro cuadrado de área de superficie, y una densidad de aproximadamente 1 millón de células por mililitro. Luego, aspire las soluciones de los pozos.
A continuación, agregue las celdas a una placa con pocillos recubiertos de laminina PO / FN. Alimente las células cada dos días con 200 microlitros de medio ENC por centímetro cuadrado de superficie del pozo hasta los días 30 a 40. Se observaron esferas flotantes libres de alta calidad con superficies lisas después de la inducción de la cresta neural.
Los esferoides expresaron el marcador de cresta neural SOX10. Las neuritas se observaron entre los días 25 y 30 durante la inducción de la neurona entérica.
