El trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Biomédica Innovadora de la UCSF y la Fundación Sandler, la subvención n.º 1-FY18-394 y 1DP2NS116769-01 de March of Dimes, el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH (DP2NS116769) a F.F. y el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (R01DK121169) a F.F., H.M. cuenta con el apoyo de la beca postdoctoral de la Fundación Larry L. Hillblom, Beca T32-DK007418 de los NIH y beca postdoctoral independiente del Programa de Investigación Biomédica Innovadora de la UCSF.

1. Preparación de los medios
NOTA: Las concentraciones mencionadas a lo largo del protocolo son concentraciones finales de los componentes del medio. Prepare todos los medios en condiciones estériles en una campana de flujo laminar y almacene a 4 °C en la oscuridad. Úselo dentro de las 2 semanas.
<ol><li>Medio de mantenimiento hPSC: Mezcle el suplemento de medio de mantenimiento hPSC sin alimentador (20 μL/mL) con su medio base.</li>
	<li>Medio A: Agregue la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4; 1 ng/mL), SB431542 (10 μM) y CHIR99021 (600 nM) al medio base de diferenciación.</li>
	<li>Medio B: Agregue SB431542 (10 μM) y CHIR99021 (1,5 μM) al medio base de diferenciación.</li>
	<li>Medio C: Añadir SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) y RA (1 μM) al medio base de diferenciación.</li>
	<li>Medio de cresta neural completa (NCC): Agregue FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) y MEM NEAAs (10 μL/mL) al medio neurobasal.</li>
	<li>Medio ENC: Agregue GDNF (10 ng/mL), ácido ascórbico (100 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) y MEM NEAAs (10 μL/mL) al medio neurobasal.</li>
	<li>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1x: Diluir 500 mM de EDTA (1000x) hasta una concentración final de 500 μM en PBS. NOTA: Utilice PBS sin Ca2+ y Mg2+ en todo este protocolo a menos que se indique lo contrario.</li>
</ol>2. Recubrimiento de placas de cultivo
<ol><li>Placas recubiertas de matriz de membrana basal: Descongele rápidamente y diluya una alícuota congelada de 500 μL de matriz de membrana basal en 50 ml de DMEM:F12 refrigerado mediante pipeteo vigoroso con una pipeta serológica de 50 mL. Cubrir los pocillos con la solución diluida de matriz de membrana basal (100 μL porcm2 de superficie del pocillo) e incubarlos durante la noche a 37 °C. Aspire el medio de recubrimiento antes de usarlo. Para evitar la gelatinización de la matriz de la membrana basal, realice este paso lo más rápido posible y utilice DMEM:F12 frío para disolver la alícuota congelada. NOTA: La temperatura de la matriz de la membrana basal debe mantenerse fría durante la descongelación (en hielo) y la alícuota (tubos en hielo) para evitar la coagulación.</li>
	<li>Placas recubiertas de PO/FN/laminina: Prepare una solución de poliornitina (PO) de 15 μg/mL en PBS diluyendo un stock de 1000x. Cubrir los pocillos con 100 μL de solución de PO/PBS porcm2 de superficie de pocillo e incubar las placas durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, aspire PO/PBS y cubra los pocillos a 100 μL porcm2 de superficie del pocillo con una solución de FN/laminina/PBS recién hecha que contenga 2 μg/mL de fibronectina (FN) y 2 μg/mL de laminina. Las placas se pueden utilizar después de un mínimo de 2 h de incubación a 37 °C. Aspire FN/laminina/PBS antes de usar.</li>
</ol>3. Mantenimiento de la cultura hPSC
NOTA: Todos los pasos de incubación celular se realizan a 5% de CO2 y a 37 °C en una incubadora humidificada.
<ol><li>Aspire el medio de hPSC del cultivo de hPSC y agregue medio fresco (200 μL porcm2 de área de superficie del pozo) cada dos días hasta que las colonias sean ~80% confluentes.</li>
	<li>Para el paso, aspire el medio hPSC y lave las celdas con 100 μL de PBS porcm2 de superficie de pocillo. NOTA: Es importante utilizar PBS sin Ca2+ y Mg2+ para lavar las células.</li>
	<li>Agregue 500 μM de EDTA (100 μL porcm2 de área de superficie del pocillo). Vuelva a colocar la tapa del plato. Observe a través de un microscopio invertido y controle las células para detectar el desprendimiento de los bordes de la colonia (2-4 min).</li>
	<li>Utilice una pipeta serológica de 5 o 10 ml para transferir el mismo volumen de medio hPSC a cada pocillo y recoja mecánicamente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. NOTA: El tiempo óptimo de incubación de EDTA depende de la línea iPSC. Evite el pipeteo vigoroso para separar las colonias, ya que puede provocar una disociación excesiva de las colonias y la muerte celular. Al pasar para iniciar una placa de diferenciación, incube las células con EDTA durante 1-2 minutos más.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las celdas (2 min, 290 x g, 20-25 °C) y desechar con cuidado el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en un volumen apropiado de medio hPSC y transfiéralas a pocillos de una nueva placa recubierta de matriz de membrana basal. NOTA: Para el mantenimiento regular de hPSC, utilice una relación de paso de 1:18 a 1:24 (1:18 significa transferir un tercio de las células disociadas de un solo pocillo de una placa de 6 pocillos a una placa completamente nueva). Para iniciar una placa de diferenciación, siga una proporción de paso de 5:6.</li>
	<li>Incubar al 5% de CO2 y 37 °C.</li>
</ol>4. Inducción de la cresta neural
NOTA: Este paso se representa esquemáticamente en la Figura 1A. Comienza la diferenciación NC cuando las células son aproximadamente 80% confluentes. Esto se logrará dentro de 1-2 días cuando las células se pasen en una proporción de 5:6 (ver arriba). Iniciar la diferenciación NC en el día 0 con células hPSC pluripotentes y totalmente indiferenciadas. Para una alta eficiencia, los bordes de las colonias deben tener un mínimo de células diferenciadoras. Paso y placa hPSC para la diferenciación cuando las colonias son grandes, o el centro de la colonia comienza a engrosarse/oscurecerse cuando se monitorea con un microscopio invertido. Prestar atención a la confluencia y morfología tiende a ser más fiable que el número de células plateadas, ya que puede variar dependiendo de la línea celular y puede variar de 50.000 a 200.000 porcm2.
<ol><li>En el día 0, reemplace el medio de mantenimiento hPSC por el medio A que contenga 1 ng/mL de BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL de medio porcm2 de área de superficie de pozo).</li>
	<li>En el día 2, las células deben ser 100% confluentes. Aspire suavemente el medio A gastado y alimente las células con el medio B que contenga 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μL de medio porcm2 de superficie de pocillo). NOTA: A medida que los cultivos crecen durante la inducción de NC, las células pueden desprenderse de la monocapa subyacente. Evite la pérdida excesiva de células retirando suavemente los medios viejos y agregando medios nuevos al costado del pocillo.</li>
	<li>En el día 4, alimente las células nuevamente con el medio B (200 μL de medio porcm2 de área de superficie del pocillo).</li>
	<li>El día 6, reemplace el medio B por el medio C que contenga 10 μM de SB431542, 1,5 μM CHIR99021 y 1 μM de ácido retinoico (400 μL de medio porcm2 de superficie de pocillo).</li>
	<li>Los días 8 y 10, alimente como el día 6.</li>
</ol>5. Formación de esferoides ENC
NOTA: Este paso se representa esquemáticamente en la Figura 1B.
<ol><li>El día 12, aspire suavemente el medio C y lave las células con 100 μL de PBS porcm2 de superficie de pocillo. Añadir el mismo volumen de solución de desprendimiento de células e incubar durante 30 min al 5% de CO2 y 37 °C.</li>
	<li>Diluya la solución de desprendimiento celular agregando el mismo volumen de medio NCC que contenga 10 ng/mL de FGF2, 3 μM de CHIR99021, 10 μL/mL de suplemento de N2, 20 μL/mL de B27, 10 μL/mL de L-glutamina y 10 μL/mL DE MEM NEAA. Con una pipeta serológica, extraiga la suspensión unicelular y añádala a un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar las celdas (2 min, 290 x g, 20-25 °C) y desechar con cuidado el sobrenadante.</li>
	<li>Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue 12 ml (para una placa completa de 6 pocillos) de medio NCC y vuelva a suspender las células por completo pipeteando mecánicamente hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces. Transfiera la suspensión de la celda a una placa de fijación ultrabaja. NOTA: Aproximadamente 10cm2 de células monocapa ENC se resuspenden en 2 mL de medio NCC y se transfieren a un pocillo de una placa de fijación ultrabaja. Esto equivale a una placa de inducción NC completa de 6 pocillos transferida a una placa de fijación ultra baja completa de 6 pocillos.</li>
	<li>El día 14, agite suavemente las placas hasta que se reúnan pequeños esferoides en el centro de cada pocillo. Con una micropipeta P1000 y con un movimiento circular lento, aspire el medio NCC gastado alrededor de la circunferencia de cada pocillo. Trate de evitar eliminar los esferoides que flotan libremente.</li>
	<li>Alimente las células con el volumen original de medio NCC.</li>
</ol>6. Inducción EN
NOTA: Este paso se representa esquemáticamente en la Figura 1B.
<ol><li>El día 15, aplique la misma técnica utilizada el día 14 para eliminar suavemente el medio y lavar los esferoides con PBS. Elimine la mayor cantidad posible de PBS, evitando los esferoides.</li>
	<li>Añadir solución de desprendimiento de celda (100 μL porcm2 de superficie de pocillo) y disociar los esferoides en células individuales incubando durante 30 min al 5% de CO2 y 37 °C.</li>
	<li>Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue un volumen igual de medio ENC (que contenga 10 ng/ml de GDNF, 100 μM de ácido ascórbico, 10 μL/ml de suplemento de N2, 20 μL/ml de suplemento de B27, 10 μL/mL de L-glutamina y 10 μL/mL DE MEM NEAA en medio neurobasal) a cada pocillo y rompa los esferoides restantes mediante 2-3 rondas de pipeteo mecánico. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mL. NOTA: Evite el estrés excesivo y la muerte celular que pueden ocurrir por el pipeteo forzado o el uso de pipetas con una abertura de punta más pequeña.</li>
	<li>Centrifugar las celdas (2 min, 290 x g, 20-25 °C) y desechar con cuidado el sobrenadante. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregue ~ 5-10 mL de medio ENC y vuelva a suspender las células por completo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces.</li>
	<li>Cuente la concentración de células viables usando azul de tripán y un método de conteo de células como un hemocitómetro. PRECAUCIÓN: Se sospecha que el azul de tripán es un carcinógeno. Manéjelo con cuidado, deséchelo adecuadamente.</li>
	<li>Agregue suficiente volumen de medio ENC con el objetivo de recubrir aproximadamente 300,000-400,000 células viables porcm2 de área de superficie a una densidad de aproximadamente ~ 1,000,000 de células por mL. Aspire la solución de FN/laminina/PBS de los pocillos de la placa. NOTA: Elija el formato de placa de acuerdo con los ensayos previstos para los cultivos EN, ya que esta etapa marca el paso final de resiembra del protocolo. Los progenitores de las neuronas entéricas se pueden congelar el día 15. Después de disociar las esferas con la solución de desprendimiento de células, vuelva a suspender los progenitores a aproximadamente 5 x 106 células/mL en un medio de congelación como DMSO al 10% o Stem-cellbanker. Cuando sea necesario, descongele en medios ENC tibios con 5 μM de inhibidor de ROCK Y-27632. Celdas de placa en el formato de placa deseado. Reemplace el medio con ENC nuevo después de un par de horas.</li>
	<li>Agregue suavemente las células en los pocillos recubiertos de PO / FN / laminina. Evite que las burbujas queden atrapadas debajo de la suspensión de la celda, evitando que las células se adhieran al recubrimiento de PO/FN/laminina, especialmente cuando se utilizan placas con un tamaño de pocillo más pequeño, como las placas de 384 pocillos. Esto podría conducir a la muerte celular.</li>
	<li>Alimente las células cada dos días con medio ENC (200 μL porcm2 de superficie de pocillo) hasta el día 30-40, después de lo cual reduzca la frecuencia de alimentación (a una o dos veces por semana) pero duplique el volumen de alimentación (a 400 μL de medio porcm2 de área de superficie de pocillo). NOTA: Esto es importante ya que la eliminación y adición excesiva de medios podría facilitar el desprendimiento del cultivo neuronal de la superficie de los pocillos. Para prevenir prospectivamente el desprendimiento, especialmente para cultivos a largo plazo, complementar ENC con FN (2 μg/mL) y laminina (2 μg/mL) una vez por semana.</li>
</ol>

Derivación de Neuronas Entéricas a Partir de Células Madre Pluripotentes Humanas

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método robusto in vitro para obtener neuronas entéricas de hPSCs en un plazo de 30-40 días (Figura 1E) y glía entérica que expresa proteína ácida fibrilar glial, GFAP y SOX10 en cultivos más antiguos (> día 55)13,14,19,22. Estas neuronas y glía son inducidas por la diferenciación esca...

El sistema nervioso entérico (SNE) es el componente más grande del sistema nervioso periférico. El SNE contiene más de 400 millones de neuronas que se encuentran dentro del tracto gastrointestinal y controlan casi todas las funciones del intestino. La comprensión molecular del desarrollo y la función del SNE y sus defectos en las neuropatías entéricas requiere el acceso a una fuente fiable y auténtica de neuronas entéricas. El acceso al tejido primario humano es limitado, y los modelos animales no logran recapitular los fenotipos clave de la enfermedad en muchas neuropatías entéricas. La tecnología de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ha demostrado ser extremadamente beneficiosa para proporcionar una fuente ilimitada de los tipos de células deseados, especialmente aquellas que son difíciles de aislar de las fuentes primarias 2,3,4,5,6,7. Aquí, proporcionamos detalles de un método in vitro robusto y escalonado para obtener cultivos de ENS a partir de hPSCs. Estos cultivos escalables derivados de hPSC abren vías para los estudios de desarrollo, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos de alto rendimiento, y pueden proporcionar células trasplantables para la medicina regenerativa.
Los linajes de neuronas entéricas se derivan de las células de la cresta neural (NC) que siguen la ruta de desarrollo del ENS durante la embriogénesis. En los embriones, las células NC emergen a lo largo de los márgenes de la placa neural plegada. Proliferan, migran y dan lugar a muchos tipos diferentes de células, incluidas las neuronas sensoriales, las células de Schwann, los melanocitos, el esqueleto craneofacial y las neuronas entéricas y la glía 8,9,10. La decisión sobre el destino de la célula depende de la región distinta a lo largo del eje anteroposterior de la que emergen las células NC, es decir, NC craneal, NC vagal, NC troncal y NC sacra. El SNE se desarrolla a partir de células NC vagales y sacras, dominando las primeras la población de neuronas entéricas debido a la extensa migración a lo largo del intestino y colonizando el intestino11.
La derivación de células NC a partir de PSCs comúnmente implica una combinación de inhibición dual de SMAD y activación de la vía WNT12,13. Hasta hace poco, todos los protocolos de inducción de NC incluían aditivos de suero y otros productos animales en las condiciones de cultivo. Los medios químicamente indefinidos no solo reducen la reproducibilidad de la inducción de NC, sino que también desafían los estudios mecanicistas del desarrollo. Para superar estos desafíos, Barber et al14 desarrollaron un protocolo de inducción de NC utilizando condiciones de cultivo químicamente definidas y, por lo tanto, fue ventajoso sobre los métodos alternativos que dependen de factores de reemplazo sérico (por ejemplo, KSR)13,14. Esto se obtuvo mediante reemplazos de medios basales y optimización de un protocolo presentado originalmente por Fattahi et al para derivar células NC entéricas a partir de hPSCs. Este sistema mejorado es la base del protocolo de diferenciación de hPSC que se presenta aquí. Comienza con la inducción de las células de la cresta neural entérica (ENC) en un período de 15 días mediante la modulación precisa de la señalización de BMP, FGF, WNT y TGFβ además del ácido retinoico (AR). A continuación, derivamos los linajes de ENS mediante el tratamiento de células con factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF). Todas las composiciones de los medios están definidas químicamente y producen cultivos neuronales entéricos robustos en un plazo de 30 a 40 días.
Además del sistema de cultivo celular monocapa descrito aquí, se han desarrollado enfoques alternativos de inducción de NC que utilizan cuerpos embrioides que flotan libremente15,16. Se ha demostrado que las células migratorias en estos cultivos expresan marcadores NC con un subconjunto que representa el NC vagal. Se han utilizado cocultivos con tejido intestinal primario para enriquecer los precursores entéricos de NC en estos cultivos. Las composiciones de los medios en estos estudios contienen una combinación de diferentes factores, como el factor de crecimiento nervioso, NT3 y el factor neurotrófico derivado del cerebro. En esta etapa, no está completamente claro cómo estos factores podrían afectar las identidades de compromiso de los precursores de neuronas entéricas. Para una comparación eficiente de la inducción entérica de NC en los cultivos monocapa y en los cultivos basados en cuerpos embrioides, se necesitan más datos. Teniendo en cuenta los diferentes diseños de cultura en estas estrategias, el uso de cada método debe considerarse y optimizarse de acuerdo con la aplicación específica en mente.
El protocolo presentado aquí es reproducible y ha sido probado con éxito por nosotros y otros utilizando diferentes líneas de hPSC (inducidas y embrionarias) 8,14,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (serum free, minus vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix, Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14133-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model no. 5810R</td>
			<td>02262501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution, Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1475-0511, 1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation base medium, Essential 6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 no glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pluripotent stem cells, H9 ESC</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>RRID: CVCL_1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with controlled humidity, temperature and CO2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Herralcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1300 series class II, type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3400-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement, Glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAAs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plates, Falcon</td>
			<td>BD</td>
			<td>353934, 353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>CTS</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca and Mg free)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z768715-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E, 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of enteric nervous system lineages from human pluripotent stem cells

El sistema nervioso entérico humano, ENS, es una gran red de tipos de células gliales y neuronales con una notable diversidad de neurotransmisores. El SNE controla la motilidad intestinal, la secreción de enzimas y la absorción de nutrientes, e interactúa con el sistema inmunitario y el microbioma intestinal. En consecuencia, los defectos de desarrollo y adquiridos del SNE son responsables de muchas enfermedades humanas y pueden contribuir a los síntomas de la enfermedad de Parkinson. Las limitaciones en los sistemas de modelos animales y el acceso al tejido primario plantean importantes desafíos experimentales en los estudios del SNE humano. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la derivación efectiva in vitro de los linajes ENS a partir de células madre pluripotentes humanas, hPSC, utilizando condiciones de cultivo definidas. Nuestro protocolo comienza con la diferenciación dirigida de hPSCs a células de cresta neural entérica en un plazo de 15 días y produce diversos subtipos de neuronas entéricas funcionales en un plazo de 30 días. Esta plataforma proporciona un recurso escalable para estudios de desarrollo, modelado de enfermedades, descubrimiento de fármacos y aplicaciones regenerativas.

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

Autor destacado: Cultivo robusto de neuronas entéricas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas

Diferenciación de linajes del sistema nervioso entérico a partir de células madre pluripotentes humanas

Here we provide a method for generation of human enteric neurons from human pluripotent stem cells under fully defined conditions, and we use these cells in order to understand human enteric nervous system development and function. So I think human enteric nervous system development, physiology and pathophysiology has been a great challenge, and it's because of the rarity of the enteric nervous system cells and the transient nature of the neural crest progenitors, and difficulty in access to tissue and isolation of the tissue. This is a robust platform for generating authentic and functional human enteric neurons from HPSCs, and by overcoming longstanding technical challenges in tissue access, it provides scalable cultures of enteric nervous system components for disease modeling, drug discovery, and studying ENS developments and function.

Este protocolo proporciona un método para derivar la cresta neural entérica y las neuronas entéricas a partir de hPSCs utilizando condiciones de cultivo definidas químicamente (Figura 1A-B). La generación de neuronas de alta calidad depende de un paso eficiente de inducción de la cresta neural entérica. Esto se puede evaluar visualmente comprobando la morfología de las esferas que flotan libremente, que deben verse redondas con superficies lisas con un tamaño aproxi...

La derivación de linajes del sistema nervioso entérico (SNE) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) proporciona una fuente escalable de células para estudiar el desarrollo y la enfermedad del SNE, y para su uso en medicina regenerativa. Aquí, se presenta un protocolo detallado in vitro para derivar neuronas entéricas a partir de hPSCs utilizando condiciones de cultivo químicamente definidas.

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

Aquí proporcionamos un método para la generación de neuronas entéricas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas en condiciones completamente definidas, y utilizamos estas células para comprender el desarrollo y la función del sistema nervioso entérico humano. Así que creo que el desarrollo, la fisiología y la fisiopatología del sistema nervioso entérico humano han sido un gran desafío, y se debe a la rareza de las células del sistema nervioso entérico y la naturaleza transitoria de los progenitores de la cresta neural, y la dificultad en el acceso al tejido y el aislamiento del tejido. Se trata de una plataforma robusta para generar neuronas entéricas humanas auténticas y funcionales a partir de HPSC y, al superar los desafíos técnicos de larga data en el acceso a los tejidos, proporciona cultivos escalables de componentes del sistema nervioso entérico para el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y el estudio de los desarrollos y la función del SNE.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

845 vistas.  University of California, San Francisco. Aquí proporcionamos un método para la generación de neuronas entéricas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas en condiciones completamente definidas, y utilizamos estas células para comprender el desarrollo y la función del sistema nervioso entérico humano. Así que creo que el desarrollo, la fisiología y la fisiopatología del sistema nervioso entérico humano han sido un gran desafío, y se debe a la rareza de las células del sistema nervioso entérico y la natura...

Video: Autor destacado: Cultivo robusto de neuronas entéricas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls bowel motility, enzyme secretion, and nutrient absorption and interacts with the immune system and the gut microbiome. Consequently, developmental and acquired defects of the ENS are responsible for many human diseases and may contribute to symptoms of Parkinson's disease. Limitations in animal model systems and access to primary tissue pose significant experimental challenges in studies of the human ENS. Here, a detailed protocol is presented for effective in vitro derivation of the ENS lineages from human pluripotent stem cells, hPSC, using defined culture conditions. Our protocol begins with directed differentiation of hPSCs to enteric neural crest cells within 15 days and yields diverse subtypes of functional enteric neurons within 30 days. This platform provides a scalable resource for developmental studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative applications.

Deriving enteric nervous system (ENS) lineages from human pluripotent stem cells (hPSC) provides a scalable source of cells to study ENS development and disease, and to use in regenerative medicine. Here, a detailed in vitro protocol to derive enteric neurons from hPSCs using chemically defined culture conditions is presented.

Investigación

Neurociencias

Formation of Neural Crests from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To induce neural crest formation, replace the maintenance medium of the human pluripotent stem cell culture with 200 microliters of medium A per square centimeter of the well-surface. Incubate the culture under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius for two days. Gently aspirate the medium from the well-containing 100%confluence cells then pipette about 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface area.On day four, feed the cells with 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface. Incubate the cells for two more days, then replace the medium B with 400 microliters per square centimeter of medium C.

Formación de crestas neurales a partir de células madre pluripotentes humanas para la investigación del sistema nervioso entérico

Differentiation of Enteric Neural Crest Spheroid and Neuronal Induction from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To begin, take 12-day cultures of human pluripotent stem cells that have been subjected to neural crest induction. Gently aspirate medium C from the cells. Add 100 microliters of PBS per square centimeter of well surface area to wash the cells, and then remove the PBS.Add an equal volume of cell detachment solution to the cells and incubate for 30 minutes under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius. Add an equal volume of NCC medium into the plate. Then, use a serological pipette to harvest the cell suspension and transfer it to a 15-milliliter conical tube.Spin the cells at 290G for two minutes between 20 to 25 degrees Celsius. Carefully discard the supernatant without disturbing the cell pellet. Use a 10-milliliter serological pipette to pipette 12 milliliters of NCC medium to the cell pellet.Mechanically pipette the suspension up and down to create a suspension. Then, transfer the cell suspension to an ultra low attachment plate. On day 14, gently swirl the cell culture plates to gather small spheroids at the center of each well.Use a P1000 micro pipette to slowly aspirate the spent medium from the circumference of each well. Refeed the cells with the original volume of NCC medium. On day 15, carefully remove the medium.Add PBS to the wells to wash the spheroids. Then, remove as much PBS as possible, ensuring spheroids are not disturbed. Next, add 100 microliters of cell detachment solution per square centimeter of well surface area.Incubate the cells in the solution for 30 minutes under 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. With a 10-milliliter serological pipette, add an equal volume of ENC medium to each well. Mechanically pipette the solution to break any remaining spheroids.Then transfer the cells to a 50-milliliter conical tube. Discard the supernatant after centrifuging as before. Then, resuspend the cells in 5 to 10 milliliters of ENC medium.Count the concentration of viable cells using trypan blue and hemocytometer. Now, add enough volume of ENC medium to plate about 300, 000 to 400, 000 viable cells per square centimeter of surface area, and a density of about 1 million cells per milliliter. Then, aspirate the solutions from the wells.Next, add the cells to a plate with PO/FN laminin coated wells. Feed cells every other day with 200 microliters of ENC medium per square centimeter of well surface area until days 30 to 40. High quality free floating spheres with smooth surfaces were observed after neural crest induction.The spheroids expressed the neural crest marker SOX10. Neurites were observed between days 25 to 30 during the enteric neuron induction.

Diferenciación de la inducción esferoide y neuronal de la cresta neural entérica a partir de células madre pluripotentes humanas para la investigación del sistema nervioso entérico