Precaliente un mililitro de caldo LB y una placa de agar LB más gentamicina para cada muestra y controle en una incubadora estática ajustada a 37 grados centígrados. En un volumen combinado de cinco microlitros o menos, agregue de 100 a 200 nanogramos de cada plásmido auxiliar pTNS2 y el plásmido de inserción de gentamicina adeIJK pUC18-Tmini-Tn7-Tlac a una alícuota de células electrocompetentes. Mezcle con suaves golpecitos con la yema de los dedos para asegurar una mezcla completa de los plásmidos con las células electrocompetentes sin introducir burbujas.
Agregue un volumen equivalente de agua destilada estéril en la alícuota de la celda de control negativo y mezcle suavemente como se muestra antes. Incubar las muestras en hielo durante 20 minutos. Transfiera toda la muestra de células a una cubeta de electroporación helada y, a continuación, vuelva a colocar la cubeta en hielo.
Para electroporar la muestra de celda, encienda el electroporador y ajústelo a dos kilovoltios. Limpie la superficie de la cubeta con un pañuelo de papel suave para eliminar el hielo o la humedad adheridos. Inserte la cubeta en el electroporador y administre la descarga eléctrica.
Agregue inmediatamente 0,9 mililitros de caldo LB precalentado a las celdas de la cubeta y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar las celdas con el medio. Transfiera toda la suspensión celular a un nuevo tubo de microfuga de 1,5 mililitros a temperatura ambiente. A continuación, compruebe el valor de la constante de tiempo en el electroporador.
Para obtener los mejores resultados, este valor debe estar entre cuatro y seis. Incubar las muestras electroporadas a 37 grados centígrados durante una hora a 250 RPM para permitir la recuperación celular. Después de una hora, esparcir 100 microlitros de cada muestra en una placa de agar LB más gentamicina precalentada, utilizando un esparcidor de inoculación.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 16 a 18 horas. Revisa las placas de electroporación. Con palillos de dientes estériles, recoja hasta 10 colonias individuales de las placas de agar LB más gentamicina y colóquelas en una placa de agar LB más gentamicina fresca.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 16 a 18 horas. El parcheo de las colonias de placas de transformación en medios selectivos preserva la cepa transformada y proporciona material de partida para el cribado por PCR de colonias. El producto de PCR para los cebadores de cribado, ABglmS2 hacia adelante nuevo y Tn7 hacia atrás es de 382 pares de bases.
Los controles negativos de la reacción incluyen A.baumannii ATCC 17978 de tipo salvaje, AB 258 y sin plantilla.
