Purificación genómica y preparación de bibliotecas de ADN de mioblastos de ratón marcado para la elaboración de perfiles epigenéticos

Para empezar, añada 150 microlitros de tampón de marcación en los tubos de muestra que contienen las muestras de mioblastos de ratón marcadas. Pipetee EDTA, SDS y proteinasa K en cada tubo. Agite el contenido de los tubos para que se mezcle bien, luego incube los tubos a 55 grados centígrados durante dos horas en una máquina de PCR.

A continuación, pipetee cada muestra en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros que contienen 200 microlitros de mezcla de fenol y cloroformo. Vortex el contenido de los tubos para mezclarlos. Una vez completada la centrifugación, transfiera la capa superior a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, añada 200 microlitros de cloroformo en los nuevos tubos antes de volver a vórtice y centrifugar. Aspire la capa superior en un tubo nuevo. Ahora agregue 550 microlitros de etanol 100% en cada tubo de muestra y mezcle bien invirtiendo.

A continuación, coloque los tubos a menos 80 grados centígrados durante una hora para inducir la precipitación del ADN. Centrifugar la solución a máxima velocidad durante 15 minutos para obtener una bolita de ADN. Después de verter el sobrenadante, lave el pellet con etanol al 75% antes de volver a centrifugar durante cinco minutos.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en 21 microlitros de agua bidestilada. Configure el PCR que se utilizará para la preparación de la biblioteca. Utilice un cebador N7XX Illumina diferente para cada muestra y un cebador N5XX universal.

Ingrese el número de ciclo de PCR en el instrumento para ejecutar la PCR. Después de la amplificación, electroforese tres microlitros de las bibliotecas en geles de agarosa. Las bibliotecas CUT&Tag contenían en su mayoría mononucleosomas marcados de unos 300 pares de bases.

La qPCR mostró que la marca H3K4me1 estaba altamente enriquecida en las regiones potenciadoras del gen MYOD1.