Después de la incubación de las semillas de maní, después de la inoculación de esporas de Aspergillus flavus, use fórceps para quitar los trozos de semilla del agar. Coloque las piezas de semilla en frascos etiquetados de siete mililitros con cuentas que contengan 13 cuentas de cerámica de circonio. Para la extracción de fitoalexinas y aflatoxinas, dependiendo del tamaño de la semilla, agregue dos o cuatro mililitros de una mezcla de agua de metanol al frasco de perlas y pulverize a 5,5 metros por segundo durante 45 segundos.
A continuación, centrifugar a 1.860 x g durante tres minutos y recoger el sobrenadante en un vial nuevo. Para el análisis de aflatoxinas, utilizando una varilla de vidrio, cortada en un ángulo de 90 grados, inserte una frita porosa de polietileno en una columna de polipropileno de 1,5 mililitros. Con una cuchara hecha a medida, agregue 50 miligramos de gel de sílice de magnesio en la columna.
Tapa la columna con una frita idéntica y empújala hacia abajo con una varilla de vidrio. Agregue 0,5 mililitros de sobrenadante en la mini columna empaquetada a medida y deje que el extracto se drene por gravedad en un frasco de vidrio de cuatro mililitros. Agregue un mililitro de mezcla de agua y metanol en la columna para lavar las impurezas por gravedad en el mismo vial.
Después de desechar los eluidos combinados del vial, agregue 1,2 mililitros de acetona acetona acetil nitrilo agua, mezcla de ácido fórmico al 88% en la columna para eluir la fracción de aflatoxina en un vial de vidrio limpio. Evapora el disolvente del vial en una corriente de nitrógeno en un bloque calefactor a 45 grados centígrados. Después de la evaporación, tape el vial y enfríelo en dados triturados durante un minuto.
Coloque los filtros de pipeta Pasteur hechos a medida en tubos de ensayo desechables y colóquelos en hielo para minimizar la evaporación durante la filtración. Disuelva el residuo seco en una medida precisa de 0,25 a 1,0 mililitros de mezcla de agua y metanol. Después del vórtice, transfiera una alícuota de 0,2 mililitros al filtro.
Utilice gas nitrógeno para acelerar la filtración en un vial de muestreador automático de 400 microlitros. Coloque el vial en el muestreador automático UPLC y ajuste el volumen de inyección de 0,1 a 3,0 microlitros. Para la fitoalexina, transfiera 200 microlitros de sobrenadante del vial de centrífuga de siete mililitros a un filtro de pipeta Pasteur.
Después de la filtración, coloque un tapón a juego con tabique de politetrafluoroetileno en el vial. Para las separaciones de aflatoxinas, implemente un gradiente utilizando agua, metanol y nitrilo de acetilo con composiciones porcentuales y tiempos de ejecución específicos. Ajuste el caudal a 0,45 mililitros por minuto y el tiempo de ejecución a 9,5 minutos.
En el calentador de columna del sistema, ajuste la temperatura de la columna a 40 grados centígrados. Para cuantificar las aflatoxinas, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión en 362 y 440 nanómetros, respectivamente. Luego, utilizando el método de la curva de calibración y el manual del software UPCL, realice el análisis para determinar las concentraciones de aflatoxinas en las muestras de prueba.
Para la separación de los estilbenoides, utilice un gradiente compuesto por agua, metanol y ácido fórmico al 88% con condiciones y tiempos porcentuales específicos. Ajuste el caudal a 0,5 mililitros por minuto y el tiempo de ejecución a 12 minutos. Utilizando el método de la curva de calibración, determine las concentraciones de estilbenoides y compare las áreas de pico de la muestra de prueba con patrones puros y auténticos.
El método de cuantificación de aflatoxinas basado en UPLC logra una cuantificación sensible de la aflatoxina B1 con un límite de dos picogramos por inyección. El extracto purificado de semillas recolectadas de una especie silvestre de Areca mostró una cuantificación inequívoca de aflatoxinas. El enfoque de columna de gel de sílice y magnesio elimina eficazmente las impurezas de la fracción de aflatoxinas y demuestra una alta eficiencia de cuantificación en contraste con los métodos anteriores.
Además, este método también ayuda en la cuantificación de las fitoalexinas del cacahuete.
