Para comenzar, coloque un portaobjetos de COC oxidado en un molde de PDMS para el canal superior del dispositivo. Coloque el conjunto en un molde y coloque la plantilla. A continuación, apriete la plantilla con una llave dinamométrica ajustada a 0,3 newton metros.
Conecte el tubo de PTFE a la entrada del molde. Llene el dispositivo con 1.000 milibares de presión mantenida por la bomba piezoeléctrica situada en el sistema de presión. Coloque la plantilla con el portaobjetos de vidrio hacia arriba en el alineador de la máscara y expóngala a una dosis de 850 milijulios con un filtro ND33.
Ahora, ponga el OSTE estructurado en contacto con la membrana que tiene un 11,8% de mala densidad, asegurándose de que los canales estén completamente cubiertos por la membrana. Coloque un portaobjetos de vidrio limpio en la parte superior de la membrana. Aplique una presión de 1,6 kilopascales desde la parte superior para garantizar una unión uniforme.
Luego, coloque el lado de la membrana de ensamblaje hacia arriba sobre una placa calefactora a 60 grados centígrados. A continuación, alinee la capa OSTE de la estructura con el ensamblaje del canal superior. Asegúrese de que las capas superior e inferior estén alineadas y que la capa inferior de OSTE esté en contacto con la membrana.
Use un microscopio para evaluar visualmente el dispositivo en busca de defectos. Una vez hecho esto, llene dos jeringas de cinco mililitros con dos mililitros de peróxido de hidrógeno. Coloque las jeringas en una bomba de jeringa.
A continuación, conecte un tubo de PTFE de 14 centímetros de largo a las jeringas con las agujas de la jeringa. Conecte el tubo a las entradas del dispositivo con conectores luer. Conecte un tubo de PEEK de 200 centímetros de largo a las salidas del dispositivo.
Luego, conecte el otro extremo del tubo de PEEK a un contenedor de desechos. En la pantalla del instrumento, pulse Settings (Ajustes) y, a continuación, seleccione System Set (Conjunto de sistemas) y, a continuación, Syringe (Jeringa). Luego, haga clic en el botón Atrás y elija los parámetros para ingresar una velocidad de flujo de 500 microlitros por minuto.
Recoger el caudal en un contenedor de residuos. A continuación, llene dos jeringas nuevas de cinco mililitros con dos mililitros de etanol. Reemplace las jeringas usadas con las jeringas llenas de etanol, luego encienda la bomba.
Del mismo modo, llene las jeringas con cinco mililitros de PBS filtrado de 20 nanómetros. Conéctelos a la bomba y enjuague el dispositivo con cuatro mililitros de la solución PBS. Desconecte el tubo del dispositivo.
Encierre las entradas y salidas con tapones luer. Al día siguiente, enjuague el dispositivo lleno de PBS con cuatro mililitros de PBS filtrado. Recoja el último mililitro del flujo a través de ambas salidas en un tubo de baja unión a proteínas de dos mililitros.
Almacenar a cuatro grados centígrados como un espacio en blanco para las partículas introducidas por el dispositivo. Reemplace las jeringas llenas de PBS por otras llenas de aire. Luego, coloque el dispositivo con cuatro mililitros de aire hasta que todo el líquido haya salido del dispositivo y del tubo.
Para analizar las muestras de orina, primero recoja 100 mililitros de orina matutina de cada donante en recipientes estériles. Separe cada muestra en dos tubos de 50 mililitros. Centrifugar los tubos a 2.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Luego, recoge el sobrenadante. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 g durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar las partículas. Recoja el sobrenadante en tubos nuevos.
Llene una jeringa de 20 mililitros con la muestra de orina preparada y luego conéctela a la entrada de muestras del dispositivo. A continuación, llene otra jeringa de 20 mililitros con 20 mililitros de PBS filtrado tratado con DEPC y conéctela a la entrada del búfer del dispositivo. Transfiera el flujo a través de 100.000 tubos de concentración de corte de peso molecular por separado y centrifugue los tubos para concentrar 100 microlitros cada uno.
Luego, transfiera los concentrados a tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Agite los concentrados en vórtice durante 30 segundos, luego gire durante 10 segundos en una centrífuga. Transfiera 25 microlitros de cada muestra a tubos nuevos etiquetados.
Congélelos a 80 grados centígrados para almacenarlos a largo plazo. El dispositivo OSTE-COC mostró una mejor recuperación total de partículas de los biofluidos en relación con la ultracentrifugación. La recuperación utilizando el puerto R del dispositivo OSTE-COC fue ligeramente superior a la cromatografía de exclusión por tamaño y la ultracentrifugación solas.
Se encontró una distribución de tamaño equivalente entre las diferentes metodologías, con la excepción de la ultracentrifugación, que mostró una mayor distribución de tamaño de partícula. La recuperación total de partículas de ambos puertos del dispositivo mostró un rendimiento superior.
