Para comenzar, tome un portaobjetos y agréguele dos tiras delgadas de cinta adhesiva de doble cara para prepararse para la toma de imágenes. Pipetee aproximadamente de 10 a 15 microlitros de medio de montaje entre las dos tiras de cinta para el montaje del cerebro. transfiera la etiqueta cerebros de Drosophila a un portaobjetos de microscopio con una punta de pipeta P20 preenjuagada con PBS y Triton X-100 al 0,2%.
Una vez que se transfieren los cerebros, use un pincel fino para alinearlos, asegurándose de que los lóbulos de las antenas miren hacia arriba. Después de orientar los cerebros, cúbralos con un cubreobjetos de vidrio. A continuación, rellene los lados del cubreobjetos con un medio de montaje adicional.
Sella los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Después de secar completamente el portaobjetos, guárdelo en el refrigerador para obtener imágenes posteriores. Utilice un microscopio confocal de barrido láser equipado con un objetivo de inmersión en aceite 63X para obtener imágenes.
Emplee un láser de argón 488 y helio neón 543 para obtener imágenes de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal y las neuronas sensoriales olfativas Or42a. Determine la ganancia óptica y el desplazamiento para ambos canales. Coloque las imágenes en el centro del cerebro y concéntrese en los glomérulos VM7.
Localízalo aproximadamente en el agujero en el centro del cerebro. Seleccione la resolución de imagen de 1024 por 1024. Capture una proyección completa de la pila Z confocal a través del lóbulo antenal para garantizar que se capture la inervación completa de las neuronas Or42a de los glomérulos VM7.
Cargue el genotipo o la imagen cegada de la condición en Fiji. Para dividir los canales de línea láser, vaya a la imagen, haga clic en color y seleccione dividir canales. En el canal sensorial olfativo Or42a, desplácese por la pila Z para determinar qué cortes contienen la inervación de la neurona Or42a, identificando el comienzo y el final de la fluorescencia.
Para crear una proyección de segmentos de suma que incluya solo segmentos con inervación de neuronas Or42a, haga clic en la imagen y vaya a las pilas. A continuación, haga clic en Proyecto Z, seleccione segmentos de suma e introduzca el rango deseado. Utilice la herramienta de lazo en Fiji para trazar el contorno de la inervación de la neurona Or42a en el glomérulo VM7.
Multiplique la circunferencia del área trazada por el número de segmentos de pila Z y el grosor de cada corte para calcular el volumen de inervación del glomérulo sináptico VM7. Después de 24 horas de exposición a un vehículo odorante de control, persiste una inervación densa de Or42a MCD:GFP en los glomérulos VM7 de ambos lóbulos antenales. Por el contrario, una exposición de 24 horas al odorante 25%EB provoca una poda significativa y una pérdida del volumen glomerular sináptico.
El aumento de la concentración de odorante EB provoca una poda sináptica de los glomérulos progresivamente mayor. Las cuantificaciones representativas para este rango de concentraciones de odorante EB mostraron resultados similares para la intensidad de fluorescencia y el volumen de inervación.
