Este estudio es apoyado por el NIH y DC052256 DC006015, y NSF 0324769 de QG y T32-DC008072 a BS.

1. Preparación Este procedimiento es la bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, todos los preparativos se hacen las siguientes en una campana de riesgo biológico donde se realiza el procedimiento de microinyección. <ol><li> Preparar y precalentamiento a 37 ° C cama de agua: Llene una bolsa de plástico con agua - sello y situado en un bloque vacío de calefacción incubadora. Esto permitirá que los ratones a recuperarse después de la inyección. </li><li> Llenar un recipiente para residuos biológicos peligrosos con lejía al 10% a un volumen adecuado para la inmersión de todos los residuos de este procedimiento. </li><li> Prepare un plato pequeño abierto de etanol al 70% y un segundo plato con ddH2O esterilizado y el lugar en el gabinete de seguridad biológica. </li><li> Esterilizar una capacidad 5μL jeringa Hamilton con una aguja de calibre 33 rociando el cuerpo y la aguja con el 70% de etanol con el émbolo se retiró todo el camino. Repetidamente aspirado etanol a partir de la antena y expulsar todo el camino por lo menos 5 veces. </li><li> Enjuague el cartucho de la jeringa con agua estéril de aspiración y extracción de al menos 5 veces. Coloque la jeringa de forma segura a un lado de la campana de la cultura y deje que se seque. </li><li> Eliminar los stocks de virus de -80 ° C y almacenamiento en el congelador en lugar de hielo para permitir la descongelación. Microinyección requiere 2μL del stock de virus por ratón con un título de 10 9 unidades infecciosas / ml. Los lentivirus se puede obtener de fuentes comerciales o producidos en el laboratorio de acuerdo con el protocolo establecido (Lois et al., 2002). </li><li> Prepare una etapa de inyección que proporciona una zona elevada por encima de la superficie de la campana - puede utilizar una placa de cultivo de 10 cm cubierto con una sábana de Kimwipe. </li><li> Organizar toallitas con alcohol cerca de la estación de inyección. </li></ol> 2. Microinyección de partículas lentiviral en el epitelio olfatorio Todos los procedimientos de animales que hayan realizado en este método se realiza de acuerdo con las directrices aprobadas IACUC. El Mus musculus cepa C57BL/6J es el modelo animal utilizado en todos los experimentos se demuestra aquí. <ol><li> Anestesiar a crías de ratón por la hipotermia, a una cría de ratón (P0-P3) fuera de la jaula y poner el cachorro en un guante de corte abierto en el hielo durante 5 minutos. </li><li> A la espera de que el cachorro a estar completamente anestesiado, 2μL aspirado de las acciones virales en el esterilizado jeringa Hamilton. </li><li> Coloque la cría de ratón en la parte superior de la fase de inyección. Tire suavemente de la piel lejos de la parte superior de la cabeza en el oído hacia la parte superior del cuello. Esto debería proporcionar una superficie de la piel impartidas a través de la cavidad nasal y la facilidad de la inyección. </li><li> Inserte la aguja a través de la parte superior de la cavidad nasal de aproximadamente 3 mm por debajo de la superficie de la piel para alcanzar el epitelio olfativo. Microinject 0.5μL de la solución de virus por disparo, la elección de dos sitios por cada lado, izquierdo y derecho (cuatro inyecciones total por ratón = 2μL de virus es necesario). Los puntos de inyección deben ser escalonadas separados unos de otros. Para la selección de los sitios de inyección adecuada, buscar en la superficie del cráneo dorsal para el contorno del bulbo olfatorio. Esta línea es apenas visible en el nacimiento a través de la piel semi-transparente y el cráneo. Para que dos inyecciones por cada lado, el objetivo de una inyección justo rostral al bulbo de un esquema en un eje medial. Hacer la segunda inserción lateral al contorno del bulbo, sin embargo, asegúrese de que el ángulo de la inyección medial de modo que usted puede alcanzar el epitelio olfativo que se encuentra debajo de la parte ventral del bulbo. Evitar penetrar en el bulbo olfatorio! </li><li> Seque cualquier solución de virus o de la sangre residual que puede escapar de la zona de inyección o aberturas ventana de la nariz con un Kimwipe. Deseche inmediatamente Kimwipes en el recipiente de líquido blanqueador diluido riesgo biológico. </li><li> Coloque el ratón inyectado en la cama de agua incubadora. </li><li> Repita los pasos 1-4 para todos los ratones que se inyecta, recordando que se necesitan alrededor de 2μL del stock de virus por ratón. </li><li> Vamos a recuperar los ratones en la cama de agua incubadora durante 30 minutos antes de volver a su jaula de anidación original. </li><li> Disponer de la etapa de la microinyección, toallitas desinfectantes y productos de limpieza adicional de papel en la eliminación de cloro líquido de riesgo biológico. </li><li> Limpie la jeringa Hamilton por la aspiración repetida y la expulsión de etanol y agua como se hizo en los pasos de preparación. Dejar que la jeringa que se seque. </li><li> Para máxima eficiencia de transducción repetir de nuevo este procedimiento en 4 horas. OSN infectada puede ser visualizado a lo largo de la célula en tan sólo tres días. </li></ol> 3. Inmunohistoquímica de secciones flotantes bulbo olfatorio <ol><li> El sacrificio del ratón inyectado en el punto en el tiempo deseado y fijar la perfusión del tejido con paraformaldehído al 4%. Diseccionar el OB. Incubar en paraformaldehído durante la noche y del 30% de sacarosa en PBS durante la noche. Insertar en el medio de inclusión octubre en hielo seco. </li><li> Coronal secciones OB se obtienen en un 60μm de espesor con un criostato. Barrido secciones bombilla en una placa de cultivo de 10 cm con 5 ml de PBS 1x (pH 7,4). Las secciones deben mantenerse flotando en PBS para permitir a octubre dissolve. Transferencia de las secciones flotantes y PBS en un vial de 50 ml cónicos. </li><li> Permitir que las secciones que se depositan en el fondo del vial. Vacío de PBS sin aspirar a ninguna de las secciones. Enjuague las secciones de tejido con 20 ml de PBS. Repita los pasos asentarse y pasar la aspiradora. Tejido resuspender con 10 ml de PBS y las secciones de transferencia flotante a un vial de 15 ml cónicos de inmunotinción. Una vez que las secciones de tejido se han asentado, el vacío de PBS sobrenadante sin alterar los tejidos. Volver a suspender las secciones con el 0,3% Triton X-100 en 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) que permite detergente para perforar las membranas celulares. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y repetir la incubación con PBS-Tx dos veces. </li><li> Incubar las secciones de tejido en 10 ml de solución de bloqueo (5% suero de caballo en PBS-Tx) durante dos horas a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague la solución de bloqueo por lo menos dos veces con PBS-Tx durante 15 minutos cada una a temperatura ambiente. </li><li> Prepare 2 ml de una solución de anticuerpo primario en PBS-Tx. Vea la sección de Reactivos y Equipos para los anticuerpos utilizados en este experimento. </li><li> Vuelva a colocar segundo PBS-Tx lavado de bloqueo con la solución de anticuerpo primario. Incubar en una plataforma lenta oscilación (~ 30rpm) a 4 ° C durante 24-48 horas para asegurar la penetración a fondo de las secciones flotantes 60μm. </li><li> Después de la incubación, la solución de anticuerpo primario puede ser recuperada cuidadosamente con una pipeta y se almacenan a 4 ° C para su reutilización hasta dos veces más dentro de dos semanas sin una pérdida significativa de la intensidad de la tinción. </li><li> Lávese las secciones tres veces en PBS-Tx durante 20 minutos cada una a temperatura ambiente con una rotación suave (~ 30rpm). </li><li> Prepare 2 ml de la dilución del anticuerpo secundario en PBS-Tx. Aspire el último lavado y agregar la solución de anticuerpo secundario a las secciones de tejido. Envuelva el exterior de la cubeta de tinción en papel de aluminio para bloquear la luz, que puede causar photobleaching fluoróforo. Lugar envuelto en una plataforma vial lentamente balanceándose e incubar a 4 ° C durante la noche. </li><li> Desechar la solución secundaria de anticuerpos con la aspiradora de distancia. Lávese las secciones de una vez con PBS-Tx durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague dos veces más con PBS (pH 7,4) durante 20 minutos cada una a temperatura ambiente. Montaje de las secciones de tejidos teñidos en portaobjetos de vidrio con Fluoromount G. </li><li> Pantalla a través de las secciones teñidas positivamente para los axones OSN infectados y terminales de axón con un microscopio de fluorescencia. </li><li> Para construir una visión tridimensional de una etiqueta axón OSN y cenador terminal, hacer una serie de secciones ópticas a través de la profundidad de 60μm de la división de destino tejido OB (a lo largo del eje z) mediante microscopía confocal. </li><li> Esta pila de sección Z imágenes posteriormente se pueden proyectar juntos para reconstruir una perspectiva de 360 ​​º de rotación de una sola etiqueta axón OSN, incluyendo terminales de detalle jardín en su totalidad. Cualquier ángulo de rotación de una sola puede ser capturado y exportado como un archivo de imagen (es decir, JPG, TIFF) para su presentación en formato 2D. </li></ol> 4. Resultados representante Con los métodos descritos aquí, podemos transducir neuronas sensoriales olfativas por lentivirus en vivo. De esta manera hemos OSN infectados ahora visualiza con las buenas prácticas agrarias y los periodistas mCherry fluorescentes, así como con un myc-etiquetados proteína de fusión a través de inmunocitoquímica. Esta técnica proporciona una abundancia de OSN infectados. Sin embargo, la transducción se presenta esporádicamente suficiente para proporcionar OSN etiquetados individualmente, lo que permite el análisis de la morfología de las células individuales. Axones y terminales de los axones son expuestas en las secciones de tejido OB en medio de su ambiente natural por microscopía confocal (Figura 1). Toda la OSN axón terminal jardín típicamente puede ser cautivado dentro de una sección óptica de 40-50 micras. Gran aumento de infectados terminales de los axones OSN permite un análisis detallado de la morfología axonal árbol en la capa glomerular. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figura 1. Trayectoria de una sola neurona olfativa sensorial axón y su terminal de árbol. A) una sección coronal del bulbo olfativo de un ratón P7 que muestra la capa del nervio olfatorio (ONL) immunostained de OMP (rojo) y la capa glomerular (GL) immunostained con ambas OMP y Vglut2 (gris). Un solo axón olfatorio neuronas sensoriales que expresan GFP (verde) se mueve dentro de la ONL y penetra en la estructura glomerular. B) El axón terminal de la morfología de jardín dentro del glomérulo claramente de manifiesto en la expresión de GFP. Vglut2 co-tinción de color gris ilumina la superficie total glomular en el que la GFP-positivas axones elabora un aborto terminal. C) lentivirales OSN infectadas que expresan GFP (verde) en el entorno operativo. El cytostructure del epitelio olfativo se muestra con DAPI (azul). La expresión de GFP permite la visualización de los cuerpos celulares de OSN y sus procesos celulares en el entorno operativo. D) Un axón OSN y su morfología terminal con Rap1GAP2 expresión derribo por shRNA. Los lentivirus llevar un cassette de expresión con doble Rap1GAP2 ARNhc bajo el promotor del ratón U6 y las buenas prácticas agrarias con unPromotor de CMV se aplicaron a la OE. Infectados terminales de los axones olfativos exhibió un terminal más simple glorieta en comparación con la del control de las buenas prácticas agrarias solamente. Bar = 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Este protocolo es de bioseguridad nivel 2 compatible. Todas las medidas de los residuos del área de trabajo adecuada, protección personal, y virales de contención se han establecido en consecuencia. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo a las directrices de IACUC.

Microinyección de lentivirus resultados en la transferencia permanente de construcciones de genes en el ADN genómico OSN. Este enfoque nos permite realizar manipulaciones a corto plazo oa largo plazo de genes candidatos a través de la sobreexpresión o mediados del shRNA knock-down. Además, se pueden etiquetar con fluorescencia OSN solo en una línea de ratones transgénicos existentes para observar la co-localización de las poblaciones de receptores odoríferos. Microinyección es necesaria para la transducción l...

Microinyección: Los ratones recién nacidos fueron microinyección con una jeringa Hamilton 5μL (Hamilton # 7647-01) equipado con una aguja de calibre 33 (Hamilton # 7762-06). Inmunocitoquímica Reactivos: Los anticuerpos primarios: GFP anticuerpo policlonal de conejo (Molecular Probes # A-6455), el anticuerpo policlonal de pollo en contra de OMP (personalizado) (Chen et al, 2005.), Guinea anticuerpo policlonal de cerdos contra la VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticuerpos secundarios: Cy2-burro conjugado anti-conejo (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-burro conjugado anti-pollo (Jackson Immunolab # 703-165-155) y Cy5-conjugado de cabra anti-conejillo de indias (Jackson Immunolab # 106-175-008). Las secciones fueron montadas en portaobjetos de vidrio con Fluoromount G (Southern Biotech # 0010 a 01) con la solución de DAPI 50ng/mL cromatina mancha. Microscopía confocal: Z-stack imágenes fueron tomadas con una Olympus FV1000 Flouview microscopio confocal e imágenes recogidos y tratados en las proyecciones en 3D usando las baterías Olympus FV10-ASW adquisición de 2,01 confocal y análisis de software.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Desarrollo de un circuito olfativo precisa se basa en la proyección exacta de las neuronas sensoriales olfativas (OSN), los axones hacia sus objetivos sináptica en el bulbo olfatorio (OB). Los mecanismos moleculares de la OSN crecimiento de los axones y la selección no se comprenden bien. Manipulación de la expresión génica y posterior visualización de los axones OSN único y su morfología terminal de jardín hasta el momento han sido todo un desafío. Para estudiar la función génica en el nivel de células individuales dentro de un plazo determinado, hemos desarrollado una técnica basada en lentiviral para manipular la expresión génica en OSN en vivo. Partículas lentiviral se entregan a OSN por microinyección en el epitelio olfatorio (EO). Casetes de expresión de forma permanente se integra en el genoma de la OSN transducidas. Expresión de la proteína fluorescente verde identifica OSN infectados y describe su morfología completa, incluido el jardín axón terminal. Debido a los plazos de entrega cortos entre la microinyección y la detección de periodista, los estudios de la función genética se puede enfocar en un plazo muy limitado de desarrollo. Con este método, se ha detectado la expresión de GFP en tan sólo tres días y hasta tres meses después de la inyección. Hemos logrado por la sobre-expresión y del shRNA mediada por knock-down por microinyección lentiviral. Este método proporciona morfologías detallada de los cuerpos celulares y axones OSN en el nivel de células individuales en vivo, y por lo tanto permite la caracterización de la función de genes candidatos durante el desarrollo del olfato.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Se presenta una técnica de lentivirus de la manipulación genética y la visualización de un solo axón neuronas sensoriales olfativas y su arborización terminal de<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K vistas.  University of California, Davis. Se presenta una técnica de lentivirus de la manipulación genética y la visualización de un solo axón neuronas sensoriales olfativas y su arborización terminal de In vivo.

Video: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Investigación

Neurociencias

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.