La imagen de alta resolución de una sola sinapsis que expresa un sensor de glutamato rápido permite una detección de discordancia local entre la liberación y la absorción del transmisor. En el caso de la enfermedad, este método se puede utilizar para identificar sinapsis disfuncionales. Para la corrección de autofluorescencia, primero, coloque una rebanada cerebral del ratón de interés en la cámara de grabación de un microscopio de un solo fotón.
Sumerja la rebanada en líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado y utilice el objetivo de inmersión en agua de 20x para localizar el estriado dorsal. Fije las rodajas con una rejilla de nylon en un arpa de platino para minimizar el movimiento del tejido, y cambie al objetivo de inmersión en agua 63x. Usando un filtro de paso alto a 510 nanómetros, adquiera una imagen de las estructuras positivas del sensor autofluorescente y glutamato juntos.
Usando un filtro de paso alto a 600 nanómetros, adquiera una segunda imagen de las estructuras autofluorescentes solamente. Para definir el rango, utilice las intensidades medias de los 10 píxeles más brillantes y 10 más oscuros para escalar las imágenes rojas y amarillas. A continuación, realice una resta de la imagen amarilla menos roja y cambie la escala de la imagen restada para generar un archivo TIFF estándar de 8 bits para una visualización conveniente de la pelea de interés.
Para realizar una búsqueda de boutons responsivos, necesita una micropipeta de vidrio adecuada para la estimulación eléctrica. Utilice un tirador de micropipetas para producir pipetas de estimulación a partir de capilares de vidrio borosilicato con diámetros internos de punta de aproximadamente un micrómetro. Para sondear la liberación dependiente potencial de acción de glutamato de un conjunto de boutons candidatos, seleccione un aumento de 63x y un filtro de emisión de 510 nanómetros.
Cargar la imagen restada para permitir la colocación de un electrodo de estimulación de vidrio junto a una varicosidad fluorescente, evitando la proximidad de axones adicionales. En lo que las varicosidades asociadas con una bifurcación o asignación máxima dentro de una parte más profunda de la rebanada. Coloque el electrodo de estimulación cerca de la pelea de interés y apague la luz, ya que las grabaciones deben realizarse en completa oscuridad.
A continuación, encienda el sistema de aplicación de baño multicanal, con un canal que proporciona la solución de baño estándar y los otros canales que entregan los bloqueadores necesarios de los canales iónicos, transportadores o receptores de membrana, incluida la tetrototoxina para bloquear la generación potencial de acción. Controle el flujo en el lugar de grabación y encienda el estimulador para entregar pulsos de corriente despolarizante de dos a 10 microamperios a la pipeta de estimulación. La liberación ahora se activa mediante la entrada directa de calcio a través de canales cerrados de voltaje.
Para visualizar la liberación de glutamato en el espacio libre, utilizando el microscopio X, Y unidades, coloque el sensor de glutamato positivo bouton probado cerca del centro del campo de visión. Después de detener la adquisición, haga clic en la imagen con el botón izquierdo del ratón para determinar la posición X, Y del centro de la bouton en reposo. Se mostrarán las coordenadas X, Y del cursor establecido.
Utilizando los datos de calibración, calcule las coordenadas del sitio donde se debe enviar el rayo láser para la excitación de la fluorescencia del sensor de glutamato utilizando las fórmulas indicadas. Para crear una secuencia de un punto en el software de control láser, seleccione el punto en el cuadro Agregar a secuencia en la página de secuencia del software de control láser y establezca las corridas y el retardo de ejecución en cero, y la secuencia que se ejecutará en TLL. A continuación, haga clic en Iniciar secuencia.
En el software de control de la cámara, seleccione los parámetros de imagen adecuados y seleccione el inicio externo para el modo de disparo. Haga clic en tomar señal en el software de control de la cámara. A continuación, inicie el protocolo experimental establecido para el dispositivo de disparo e implemente el ensayo de protocolo experimental con la línea de tiempo adecuada, de modo que la cámara adquiera 400 fotogramas con una frecuencia de 2,48 kilohercios durante un ensayo, con una frecuencia de repetición de 0,1 hercios o menor.
Para identificar sinapsis patológicas, active las rutinas de elevación y calcule la intensidad de fluorescencia, la media y la desviación estándar para la región de interés seleccionada en reposo. Determinar y encajonar el área ocupada por píxeles con una intensidad de fluorescencia en reposo mayor que la media más tres desviaciones estándar, y determinar un diámetro virtual en micras asumiendo una forma circular del área de umbral supra. Trazar la intensidad de fluorescencia contra el tiempo, como la diferencia entre el valor real de intensidad de fluorescencia y el valor de intensidad de fluorescencia en reposo dividido por el valor de intensidad de fluorescencia en reposo.
Determinar la amplitud máxima de la respuesta de fluorescencia. Realizar un ajuste monoexponencial para la descomposición desde el pico de la respuesta de fluorescencia, y determinar la constante de tiempo de la descomposición, TauD. Para estimar la amplitud máxima en una sinapsis determinada, seleccione el píxel con el cambio más alto en la intensidad de fluorescencia, que es el mejor indicador de la carga de glutamato presentada a la máquina de aclaramiento de la sinapsis.
Las imágenes de una sola sinapsis se pueden utilizar para identificar dos clases de sinapsis corticostriatales utilizando los criterios de tamaño y relación de pulso emparejados. A intervalos de estímulo de 20 a 50 milisegundos, los terminales interenterochefálicos más pequeños son propensos a la depresión del pulso emparejado, mientras que los terminales del tracto piramidal más grandes mostraron una facilitación del pulso emparejado. Las pruebas sobre el comportamiento motor realizadas en ratones de tipo salvaje y ratones que expresan un fenotipo de Huntington, revelan una relación positiva significativa entre los resultados obtenidos para la ruta total ejecutada en el campo abierto, y el paso sobre la latencia.
Además, la imagen de glutamato sinapsis única muestra que los ratones sintomáticos de Huntington mostraron un déficit en la velocidad de la caries por glutamato yuxtasinpático, como se refleja en los valores taud de las respuestas de glutamato a la estimulación de una sola sinapsis. En animales salvajes, dicha prolongación sólo se observó después de la aplicación de un inhibidor selectivo y no transportable de la absorción de glutamato. La evaluación de la probabilidad de aparición de un valor TauD dado en rodajas de ratones de tipo salvaje, y ratones que expresan los síntomas de la enfermedad de Huntington, reveló que en animales de tipo salvaje, TauD nunca supera los 15 milisegundos.
Sin embargo, en la enfermedad sintomática de Huntington, el 40% de las sinapsis exhiben valores de TauD entre 16 y 58 milisegundos, a pesar de una tendencia a una reducción en la cantidad de glutamato liberado. Por lo tanto, TauD podría ser considerado como un biomarcador para las sinapsis disfuncionales en la enfermedad de Huntington, y también se puede utilizar para verificar la recuperación funcional en experimentos dirigidos al transporte de glutamato astrocítico. Este protocolo para el monitoreo de glutamato en sinapsis corticostriatales individuales puede ayudar a aclarar el papel de la deficiencia de absorción de glutamato en la patogénesis de la enfermedad neurodegenerativa.
La imagen de una sola sinapsis es particularmente útil para explorar sitios presinápticos de sinapsis excitatorias.
