Para comenzar, seleccione un medio de crecimiento de nematodos o una placa NGM ocupada por larvas de Caenorhabditis elegans en etapa L1 hambrientas. Con un mililitro de agua estéril, lave suavemente los gusanos del plato. Alícuota de aproximadamente 300 microlitros de la población de lombrices en placas de NGM sembradas con OP50 concentrado.
Deje que las placas se sequen con un secador de placas o un mechero Bunsen, y luego incube a 20 grados centígrados hasta que una población significativa se convierta en adultos grávidos. Para recoger las lombrices, lávelas del plato con hasta 10 mililitros de agua estéril y transfiera una mezcla de agua tibia a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que los gusanos se asienten por gravedad en el fondo del tubo durante aproximadamente cuatro minutos.
Con una punta de pipeta pequeña, aspire con cuidado y deseche el sobrenadante. Luego agregue hasta 15 mililitros de agua estéril. Después del lavado final, retire el sobrenadante y agregue cinco mililitros de una solución recién preparada de lejía e hidróxido de sodio.
Incuba las lombrices durante cinco minutos a temperatura ambiente mientras las agitas en vórtice cada minuto durante al menos 10 segundos. Monitoree el progreso usando un microscopio de disección. Una vez que todos los adultos se abran o se disuelvan, agregue tampón M9 para neutralizar la reacción, lo que eleva el volumen final a 15 mililitros.
A continuación, centrifugar el tubo durante dos minutos a 1.300 G. Lavar los huevos dos veces más con 13 mililitros de tampón M9 mediante centrifugación seguida de un solo lavado con 15 mililitros de tampón S completo. A continuación, centrifugar los huevos durante dos minutos a 1.300 G.Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y añadir 10 mililitros de tampón S completo. Gire el tubo suavemente a temperatura ambiente durante la noche con un mutador o un dispositivo similar.
Con un microscopio de disección, evalúe si los gusanos han eclosionado. Cuente los gusanos en gotas de 10 microlitros de tampón S bajo el microscopio. Prepare una mezcla líquida de lombrices con 60 lombrices por mililitro en un medio completo S que contenga carbenicilina, anfotericina B y OP50.
Agregue 120 microlitros de medio con gusanos a las filas A a G y sin lombrices medio a la fila H. Luego selle la placa con un sellador de cinta para evitar la contaminación y la evaporación. Incubar las placas selladas durante aproximadamente 65 horas a 20 grados centígrados hasta que los animales se conviertan en gusanos L4. Agregue 30 microlitros de una solución madre de fluorodesoxiuridina de 0,6 milimolares a cada pocillo para esterilizar a los animales en la etapa L4.
Vuelva a sellar la placa con selladores de cinta y agítela durante 20 minutos a 800 RPM en un agitador de placas de microtitulación. Regrese las placas a la incubadora a 20 grados centígrados. Al día siguiente, agregue la droga de interés a la cultura del primer día.
Vuelva a sellar las placas con sellador de cinta y agite durante 20 minutos a 800 RPM en un agitador de placas. Luego, después de quitar la tapa y el sello, mida el OD600 en un lector de placas para la medición del primer día. Vuelva a sellar y devuelva las placas a una incubadora a 20 grados centígrados.
Usando un microscopio invertido, preferiblemente con un objetivo de dos veces, cuente la población de gusanos en cada pocillo y registre los números en una hoja de cálculo. Después de contar, regrese las placas a la incubadora a 20 grados centígrados. La curva de dosis-respuesta, un cambio completo en la ingesta de alimentos en función de la concentración de serotonina, mostró que la cepa N2 puede comer en exceso de manera dependiente de la dosis.
El mutante daf-16 mu86 exhibe una mayor alimentación basal que N2. Sin embargo, no puede responder a la serotonina de la misma manera dependiente de la dosis que la cepa N2. Se observó una diferencia significativa en la ingesta de alimentos de gusanos tratados con loxapina pero alimentados con bacterias muertas por rayos X, rayos gamma o paraformaldehído. La comparación de la ingesta de alimentos de una serie de cepas genéticas mostró que los mutantes exc-4 y cgr-1 comen menos, mientras que los mutantes srp-6 comen más.
