Para comenzar, coloque una alícuota de liposomas en un baño de agua a temperatura ambiente para descongelar las vesículas. Preequilibre un extrusor equipado con un filtro con tampón A. A continuación, pase los liposomas descongelados al extrusor 13 veces. Recoja los liposomas extruidos en un tubo de plástico, minimizando el volumen muerto.
A continuación, pipetee un mililitro de la solución liposomada diluida en una cubeta transparente. Mida su densidad óptica inicial a 540 nanómetros con un espectrofotómetro. Añadir 50 microlitros de Triton X-100 al 10% a los liposomas.
Cuando la solución haya alcanzado la densidad óptica máxima, mátela contra Triton X-100 hasta obtener una densidad óptica del 60% de saturación. Vierta las vesículas desestabilizadas con detergente nuevamente en el tubo de plástico. A continuación, agregue la proteína de membrana purificada a los liposomas desestabilizados hasta obtener una proporción deseada de 400 a 1.
Nutar las muestras a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, añade 200 miligramos de perlas de poliestireno deshidratado y lavado denso para eliminar el detergente. Ahora asegure una columna de flujo de gravedad vacía de 10 mililitros sobre un tubo de ultracentrificación vacío de 6,5 mililitros colocado sobre hielo.
Vierta la muestra en la columna de flujo por gravedad y recoja los proteoliposomas en el tubo de ultracentrifugación. Añade 0,5 mililitros de tampón A a las cuentas. Recoja el filtrado en el tubo de ultracentrifugación.
A continuación, coloque los liposomas en una ultracentrífuga para concentrarlos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender los proteoliposomas peletizados en un volumen total de 200 microlitros de tampón A. Divida el volumen final de los proteoliposomas en tres alícuotas. Las bajas cantidades de Triton X-100 inicialmente resultaron en un aumento de la absorbancia a 540 nanómetros.
La adición posterior resultó en la solubilización parcial de las vesículas. En nuestro Rsol, los liposomas estaban completamente solubilizados.
