Comience por transfectar las células T HEK 293. Tres días después de la transfección, retire el medio de los pocillos y lávese una vez con PBS. Agregue 500 microlitros de tripsina a cada pocillo.
Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados para separar todas las células de la placa. A continuación, añada 500 microlitros de medios DMEM completos a cada pocillo y vuelva a suspender las células. Transfiera todas las celdas de cada pocillo a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.
A continuación, centrifugar durante dos minutos a 1.000 g a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo y lave el pellet una vez con un mililitro de PBS. Nuevamente, retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de PBS.
Transfiera las células a los tubos FACS. Analice las células con un citómetro de flujo. Cargue la suspensión de celda sin resecar.
En la hoja de trabajo de citometría de flujo, presione Adquirir y ajuste los voltajes de dispersión frontal y lateral. Para colocar las celdas en la región media, cierre alrededor de esta población R1 para excluir los desechos en el cuadrante inferior izquierdo. Cambie la puerta de FL1, FL2 dot blot a G R1. Seleccione la herramienta de compuerta cuádruple y haga clic en el extremo superior derecho de la población de celdas en la mancha de puntos FL1/FL2 como G R1. Ajuste los voltajes FL1/FL2 para colocar las celdas en el cuadrante inferior izquierdo.
Presione Pausa y Anular. A continuación, cargue las celdas de control de un solo color GFP. Presione Adquirir y ajuste la compensación para colocar las celdas positivas de GFP en el cuadrante inferior derecho.
Presione Pausa y Anular. A continuación, cargue las celdas de control de un solo color mCherry. Presione Adquirir y ajuste la compensación para colocar las celdas mCherry positivas en el cuadrante superior izquierdo.
Presione Pausa y Anular. Haga clic en Adquirir en la barra de menú y seleccione Almacenamiento de adquisición. En los criterios de recopilación, seleccione La adquisición se detendrá cuando se cuenten 10 000 de los eventos G1 R1.
Cancele la marca de verificación de Configuración. Cargue las celdas de muestra. Presione Adquirir y espere hasta que se hayan contado 10.000 celdas G1 R1.
Repita lo mismo para otras muestras y controles.
