Para empezar, importe todos los archivos de fax en el panel de análisis. Abra uno de los archivos para ver el diagrama de dispersión lateral hacia adelante. Construya una puerta de polígono para aislar las celdas intactas, evitando los escombros en la esquina inferior izquierda de la gráfica.
Etiquete la subpoblación como celdas intactas y arrastre esta puerta a la barra de todas las muestras. Verifique la compuerta de cada muestra mediante el botón siguiente muestra. Haga doble clic en la subpoblación de células intactas de la muestra de control negativo para que aparezca un nuevo gráfico.
Ajuste el eje de trazado a FL1-H en el eje X para representar GFP y FL2-H en el eje Y que representa mCherry. A continuación, seleccione la herramienta de compuerta cuádruple y haga clic en el extremo superior derecho de la población de células negativas. Arrastre las cuatro puertas rectangulares a la barra de celdas intactas.
Examine cada muestra de controles de un solo color GFP o mCherry para ver si hay una compuerta correcta con el botón de la siguiente muestra. Vaya al editor de diseño. Aquí, seleccione gráficos representativos y elija copiar al editor de diseño.
Seleccione todas las gráficas representativas y luego haga doble clic para abrir la definición del gráfico. Asigne un nombre a la etiqueta del eje X como GFP y a la etiqueta del eje Y como mCherry. Determine la eficiencia relativa de la reparación del ADN comparando el número de células GFP positivas con el número de células mCherry positivas dentro de la misma parcela.
Se implementó una estrategia adecuada de ajuste de compensación y compuerta para garantizar la precisión de los análisis de NHEJ y RRHH. Esta estrategia posicionó a las células GFP positivas en el cuadrante inferior derecho y a las células mCherry positivas en el cuadrante superior izquierdo. El porcentaje de células GFP positivas indicó la reparación de DSB del ADN y la eficiencia de la transfección.
Por el contrario, el porcentaje de células mCherry positivas reflejó solo la eficiencia de la transfección. La eficiencia de reparación de DSB en el ADN se calculó como la relación entre las células positivas para GFP y las células positivas para mCherry. Además, se demostró el papel de la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich y de la proteína SCAR Humalog o WASH en la reparación del ADN utilizando el ensayo NHEJ en células shCONTROL y shWASH.
La pérdida de WASH disminuyó la eficiencia de la NHEJ, lo que subraya su papel en la promoción de la NHEJ.
