Irradiación y procesamiento de organoides tumorales derivados del paciente para la evaluación de la radiosensibilidad mediante imágenes en vivo

Para comenzar, obtenga un organoide tumoral derivado del paciente o PDTO y agregue tres mililitros de medio de cultivo DMEM F/12 enriquecido fresco al PDTO cada tres o cuatro días. Usando el irradiador de la plataforma de radiación de investigación de animales pequeños, irradie las cúpulas que contienen PDTO en el modo de campo abierto. Inmediatamente después de la irradiación, lave cada PDTO que contenga una cúpula Nagrigel con dos mililitros de medio DMEM F/12 enriquecido.

Luego, usando un P 1000, resuspenda el PDTO en uno a tres mililitros de una enzima recombinante obtenida comercialmente. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 50 mililitros e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Centrifugar el tubo para granular las células y aspirar el sobrenadante para dejar aproximadamente un mililitro de enzima recombinante en el tubo.

A continuación, lavar las células con medio DMEM F/12 enriquecido y filtrar la suspensión celular en un filtro de malla de 40 micrómetros para eliminar los grupos de células, teñir una pequeña muestra de las células filtradas con azul de tripina al 10% en PBS y contarlas en un contador de células automatizado. Resuspender las células para lograr una densidad de 800 células en 50 microlitros de medio enriquecido con 66% de magrigel. A continuación, cada cúpula en pocillos separados de una placa de cultivo de 48 pocillos compatible con imágenes e incubar la placa para permitir que el magrigel se solidifique.

Por último, añada de 0,5 a un mililitro de medio DMEM F/12 enriquecido a cada pocillo para obtener imágenes en directo.