Para observar la localización subcelular de GFP, después de 48 horas de agroinfiltración de Nicotiana benthamiana, seleccione una hoja plana y haga un agujero de seis milímetros con una perforadora. Gotee la solución de sacarosa al 30% en un portaobjetos de vidrio. Coloque la muestra de hoja con la parte posterior hacia arriba y cúbrala con un cubreobjetos.
Recoja las hojas intactas y frescas de N. benthamiana que expresan GFP recombinante a los tres días después de la agroinfiltración, y pese las hojas. Enjuague la hoja con agua preenfriada, esterilizada y doblemente destilada para eliminar los desechos. Sumerja 20 gramos con el lado abaxial hacia abajo en 500 mililitros de tampón de fosfato de 100 milimolares preenfriado en un vaso de precipitados de boca ancha de 1.000 mililitros.
Cubre las hojas con nylon de malla 100, hilo de malla fina y una placa de plástico. Conecte el vaso de precipitados a una bomba de vacío. Aplique una aspiradora de 0,8 megapascales durante un minuto y, a continuación, restablezca rápidamente la presión atmosférica.
Retire las hojas del tampón y séquelas suavemente con papel absorbente. Enrolla las hojas y envuélvelas con hilo de malla. Para recolectar líquido de lavado apoplástico, o AWF, coloque las hojas enrolladas con la punta hacia arriba en tubos de centrífuga de 50 mililitros con hilo de malla sujeto por las tapas de los tubos.
Centrifugar las hojas a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire las hojas y recoja AWF con una pipeta. Agregue resina de níquel Sepharose excel a un tubo en una proporción de uno a 1, 000 en relación con el volumen del extracto de proteína.
Lave la resina de níquel tres veces con 10 veces el volumen de resina de agua bidestilada y tampón de fosfato por separado, a su vez. Incubar el extracto de proteína con resina de níquel durante dos horas para permitir una unión completa. A continuación, centrifugar a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para eliminar las proteínas no unidas del sobrenadante.
Lavar tres veces con 20 veces el volumen de resina del tampón de fosfato. Después del último lavado, agregue 10 veces el volumen de resina de 250 milimolares de imidazol para eluir los GFP. Centrifugar la mezcla a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante.
El análisis de Western blot confirmó la expresión transitoria de GFPs de proteínas recombinantes de 30 kilodalton en N. benthamiana. La microscopía de fluorescencia ilustró la presencia de GFPs dentro del apoplasto. Las proteínas AWF extraídas por centrifugación por infiltración al vacío también contenían GFP.
De las ocho soluciones de extracción probadas, el tampón de fosfato extrajo la mayor cantidad de AWF y GFP. La comparación del tampón de fosfato a pH variable reveló una mejora en la extracción de AWF y GFP en condiciones neutras a ligeramente alcalinas. Además, el tampón de fosfato de 100 milimolares mostró la máxima eficacia para recuperar AWF y GFP.
Con un tampón de fosfato de 100 milimolares, se recuperaron 495 microgramos de proteínas AWF totales por gramo de hoja fresca del apoplasto. El AWF extraído contenía 10 microgramos de GFP, que correspondían a aproximadamente el 18% de las GFP en la proteína soluble total. Después de la cromatografía de afinidad de níquel, la pureza de las GFP alcanzó el 84,3% de la extracción con AWF, sustancialmente más alta que la pureza del 44,9% lograda mediante la extracción de proteínas solubles totales.
