VN es apoyada por la Royal Society. JPR es un Fellow futuro Consejo de Investigación Australiano (FT0992129). Damos las gracias a la Dra. Miriam Gifford para la lectura crítica del manuscrito.

Nota: todos los pasos se realizan a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. 1. Preparación de materiales vegetales y Buffers <ol><li> Por N. benthamiana <ol><li> Crece el Agrobacterium tumefaciens cepas de interés para la expresión transitoria (en este ejemplo Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG y el vector vacío como control) mediante agitación (200 rpm) en cultivo líquido (medio L con los antibióticos apropiados) a 28 ° C hasta fase estacionaria. </li><li> Recoger y sedimentar agrobacteria por centrifugación (3000 × g durante 5 min). Desechar el sobrenadante y resuspender agrobacteria sedimentadas en tampón de infiltración. </li><li> Medir la cantidad de agrobacterias mediante la obtención de la densidad óptica (DO) a una absorbancia de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste el OD de las bacterias a 0,1-0,8. </li><li> Infiltrarse en 4 semanas de edad N. benthamiana plantas (22 ° C, 16 horas de luz) con agrobacterias por HanD (con una jeringa sin aguja 1 ml) o por vacío (añadir 0,02% v / v de agente tensioactivo). Nota: Utilice la primera hoja casi totalmente ampliado, y las dos hojas de inmediato mayores para la expresión de proteínas más eficaz. Para la detección de las proteínas ubiquitinadas o acetilados infiltrar hojas con 100 nM MG-132 o 100 ng / ml de tricostatina A, respectivamente, en 1 y 2 días después de la infiltración. </li><li> Recoger las hojas infiltradas 2-5 días después de la infiltración y la congelación en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras en un -80 ° C congelador. Nota: Determine el mejor nivel de expresión de la proteína de interés con anterioridad por la toma de muestras durante un transcurso de tiempo de 5 días y detectar los niveles de proteína mediante inmunotransferencia. </li></ol></li><li> Para A. thaliana líneas transgénicas estables <ol><li> Crecer A. thaliana semillas en placas de 6 pocillos suplementado con 5 ml de medio MS líquido (1% w / v de sacarosa) por pocillo. Pon en juego tres a cinco semillas (esterilizados y estratificadas) de la línea transgénicade interés o de la línea de control no transformada por pocillo. Agitar a 200 rpm durante dos días antes de la transferencia de la placa a una cámara de crecimiento y dejar actuar durante 2 semanas (22 ° C, 10 horas de luz). </li><li> Muestras de la cosecha y la congelación en nitrógeno líquido. Nota: Se puede utilizar como control una línea transgénica que expresa una proteína no relacionada con la misma etiqueta que la proteína de interés. </li></ol></li><li> Tampones <ol><li> Preparar Tampón A. De gas de la memoria intermedia durante 1-2 horas (para RLKs, otras proteínas unidas a la membrana y las proteínas nucleares, añadir 1% v / v de IGEPAL CA-630 53). Nota: Puede mantener tampón A a 4 ° C indefinidamente. Usted puede utilizar el 1% v / v Triton lugar de IGEPAL CA-360. </li><li> Prepare 80 ml de tampón B frío al menos 1-2 horas antes de la extracción. Nota: La proporción ideal de tejido vs tampón de extracción es 1:04 (w / v). </li></ol></li></ol> 2. Extracción de proteínas <ol><li> Justo antes de la extracción preparar 80 ml de tampón C. fría <li> Moler 20 g de N. tejido benthamiana (aproximadamente 15 hojas) o A. thaliana plántulas (2-4 g por placa de 6 pocillos) en nitrógeno líquido utilizando un mortero. </li><li> Añadir 80 ml de frío tampón C a los 20 g de tejido molido, mezclar bien, y descongelar en hielo. Nota: Moler todas las muestras al mismo tiempo (proteína de interés y el control). </li><li> Homogeneizar con 3 ráfagas de 10 segundos cada uno a toda velocidad con un homogeneizador de tejidos (previamente enfriado a 4 ° C). Filtrar a través de un tejido de 22-25 micras y se centrifuga a 30.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Nota: Como alternativa, homogeneizar con un mortero y una maja preenfriado fresco. </li><li> Para los pasos de bloqueo y lavado de la matriz de afinidad, preparar 20 ml de tampón D. </li><li> Bloque 100 ml de matriz de afinidad adecuada utilizando 500 ml de tampón enfriado D que contienen 1% de BSA durante 5 min a 4 ° C. Nota: Preferido AFmatrices Finity incluyen anti-FLAG M2 agarosa, estreptavidina agarosa, GFP-Trap_A y anti-HA agarosa. </li><li> Lave 3 veces con 1 ml de frío Buffer D. </li><li> Aspirar el sobrenadante del extracto de la hoja y el filtro a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras en un nuevo tubo en hielo. Nota: El color extracto debe ser de color verde o amarillo, y si la muestra ha vuelto marrón, desechar y volver a empezar. </li><li> Tomar una alícuota del extracto crudo de inmunoblot, añadir 5x tampón SDS-PAGE de carga, vórtice y desnaturalizar las muestras de ebullición durante 10 minutos a 80-100 ° C en un bloque de calor. </li></ol> 3. La inmunoprecipitación de proteínas <ol><li> Dividir el extracto de proteína en dos tubos de 50 ml y añadir 50 l de la matriz de afinidad en suspensión en Tampón D a cada tubo. Incubar con rotación suave durante 2 horas a 4 ° C. Nota: no se han encontrado las incubaciones más largas para aumentar el rendimiento. </li><li> Preparar 600 l (6x de volumen del grano de matriz de afinidad) de tampón de elución añadiendo aTampón D (concentraciones finales): 0,5% de BSA, péptidos 0,25 mg / ml BANDERA (por anti-FLAG M2 agarosa) o 10 mM D-biotina (por estreptavidina agarosa). Nota: La elución no se recomienda en el caso de las matrices de las buenas prácticas agrarias-Trap_A y anti-HA, así que vaya directamente a ebullición en 1x tampón SDS-PAGE de carga, paso de 3.11. </li><li> Precipitar la matriz de afinidad por centrifugación a 4 ° C (5 min a 1.000 xg). </li><li> Tomar una alícuota del extracto no ligado por inmunoblot, deseche el resto del sobrenadante, dejando aproximadamente 500 l en el fondo del tubo. </li><li> Resuspender la solución en suspensión con una punta de gran calibre. </li><li> Transferir la solución en suspensión mixta de los dos tubos a un único tubo de 1,5 ml. Nota: A partir de ahora, tendrá que utilizar 1,5 ml bajas en proteínas de unión a tubos de microcentrífuga. </li><li> 3x pulso durante 5 segundos usando una centrífuga de sobremesa para precipitar la matriz de afinidad y eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar 3 a 5 veces con 1 ml de tampón enfriado D. Entre los lavados precipitar el matri afinidadx tal como se describe anteriormente y descartar el sobrenadante. En el último lavado eliminar el exceso de tampón D con la aguja de una jeringa. Nota: Un lavado final con tampón D con 0,1% de Igepal se puede utilizar para reducir aún más la unión no específica. </li><li> Eluir con 200 l de tampón de elución apropiado (por M2 anti-FLAG o estreptavidina, véase el paso de agarosa 3,2) 3x, 5 min cada vez con agitación constante. </li><li> Reunir las 3 eluatos en un solo tubo. Se concentran las proteínas mediante el uso de 30 l de resina de absorción. Vortex, dejar reposar durante 5 minutos y precipitar la resina (2 min a 10.000 xg). Eliminar el sobrenadante. Nota: Para GFP-Trap_A y anti-HA agarosa, omita los pasos 3,9 y 3,10. </li><li> Añadir 50 l de 1x tampón SDS-PAGE de carga a la matriz de afinidad precipitada o resina de absorción. Vortex y hervir durante 10 minutos a 80-100 ° C en un bloque de calor. </li><li> Centrifugar la matriz de afinidad hervida o resina durante 2 min a 10.000 x g. Alícuota de 5 l de la supernatant para inmunotransferencia, y correr con otras fracciones en un ~ 10 cm de largo en gel de SDS-PAGE (Figura 2). </li><li> Para la separación e identificación de proteínas fosforiladas por espectrometría de masas, cargue los 45 l restantes en un ~ 19 cm de largo en gel de SDS-PAGE, si se requiere la separación adicional (Figura 2). Nota: Un carril en blanco puede ser incluido entre todas las muestras para reducir la contaminación de las muestras. </li></ol> 4. La digestión de proteínas <ol><li> Teñir el gel SDS-PAGE con azul brillante de Coomassie coloidal (CCBB) mancha. Nota: Minimizar la manipulación del gel para reducir la contaminación con las queratinas. Asegúrese de que ninguno de los equipos o herramientas se han utilizado para inmunotransferencia u otras actividades que podrían haber dejado la contaminación residual de proteínas. </li><li> Destain el gel con el lavado abundante en agua, preferiblemente O / N. Cortar la banda de interés a partir del gel con una hoja de afeitar limpia. Nota: Alinear el gel con el inmunoblot si necessary para localizar el área correcta. Como la fosforilación puede retrasar la migración de las proteínas en SDS-PAGE cortar el área inmediatamente por encima y por debajo de la banda de interés. </li><li> Cortar la rodaja de gel en cubos de 2-4 mm (esto asegura que el gel será cubierto por soluciones en el tubo sin bloquear las puntas de pipeta). Colocar en un tubo. </li><li> Estimar la cantidad necesaria para mantener el gel bien sumergido. Use esta cantidad para la derivación, la incubación con proteasa y la extracción de péptidos, y luego usar el doble de volumen de triples para el lavado. Nota: En un típico digerir con aproximadamente 100 l de las piezas de gel de corte, utilice 500 l solución para el lavado, 2 x 180 l para la deshidratación, 150 l de reducción, 120 l de alquilación, y 120 l para la digestión. </li><li> Lave las piezas de gel 2 x 20 min (o hasta destained) mediante la adición de 50% de acetonitrilo (en bicarbonato amónico 50 mM, ABC). Pipetear fuera la solución con cuidado de no quitar piezas de gel. </li><li> Deshidratar con 100% acetonitrilo durante 5 minutos y retirar el líquido libre. Nota: El gel debe aparecer encogida y blanco. Si persiste el color azul, incubar ya en acetonitrilo / ABC y / o a temperatura elevada (45-55 ° C). </li><li> Reducir los enlaces disulfuro de la proteína mediante la adición de DTT 10 mM en agua y se incuba durante 30-45 minutos a 56 º C con agitación. Retire cualquier líquido libre. </li><li> Residuos de cisteína alquilato por adición de cloroacetamida mM 55 (en mM ABC 50) durante 20-30 min (temperatura ambiente, oscuro). Retire cualquier líquido libre. </li><li> Lavar piezas de gel 2 x 10 min con 50% de acetonitrilo (en mM ABC 50). Retire cualquier líquido libre. </li><li> Deshidratar piezas de gel con acetonitrilo al 100% durante 5 minutos y retirar el líquido libre. </li><li> Para la digestión tríptica, añadir 40 l de solución de trabajo de la tripsina (100 ng de tripsina en tampón de digestión: mm ABC 50, acetonitrilo 5% en el caso de una banda teñida con Coomassie promedio). Permitir piezas de gel para rehidratar durante 10 min. Agregar suficiente de tampón de digestión para cubrir piezas de gel, si es necesario. Incubar a 37 º CO / N. </li><li> Para detener la digestión y extraer los péptidos a partir de las piezas de gel, se añade ácido fórmico al 5% (en 50% de acetonitrilo) (añadir el mismo volumen que el volumen de la digestión). Déjelos en remojo durante 5-10 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Repetir la extracción de 3x. </li><li> Seque los péptidos mediante liofilización (preferido) o un concentrador de vacío (como Speed-Vac o Savant). Almacenar a -20 º C. </li><li> Envíe su muestra para la espectrometría de masas. Nota: Le presentamos nuestra muestra a la instalación de la espectrometría de masas en el Laboratorio Sainsbury (Norwich, Reino Unido). Protocolos en las instalaciones de espectrometría de masas varían considerablemente, pero típicamente péptidos se disuelven en ácido trifluoroacético 0,2% con 2% de acetonitrilo antes de cargar en un sistema de cromatografía líquida acoplada a electro-pulverización espectrometría de masas en tándem. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto (financieros u otros).

Elucidar el mecanismo de la activación del receptor por el PAMP y efectores puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión de la inmunidad de las plantas. En los últimos 20 años, híbrido de dos pantallas genéticas y levaduras han sido fundamentales para el descubrimiento de derechos y responsabilidades parentales y las proteínas NB-LRR. Más recientemente, los protocolos basados ​​en espectrometría de masas se han establecido para la identificación de proteínas reguladas diferencialmente durante inmune de señalización 55-58, sus PTM 11,33,59,60, la composición de los complejos inmunes 61 y efector se dirige a 62. Aquí se describe un protocolo sencillo para la identificación de PTM que regulan la activación de los complejos inmunes. En comparación con los protocolos descritos anteriormente, este protocolo permite la identificación detallada de los cambios dinámicos de la PTM. Protocolos de los enfoques de la proteómica a gran escala pueden identificar PTM de proteínas, pero no son capaces de revelar la plasticidad sitio de PTM debido a limitared cantidades de proteína. En el caso de la fosforilación de proteínas, proteómica enfoques a gran escala típicamente sólo identifican los sitios de fosforilación predominantes 11,33,59. La caracterización detallada de un estado de fosforilación de la proteína requiere una cantidad sustancial de proteína que se puede obtener sólo a través de la purificación parcial de la proteína diana 47. El protocolo descrito aquí parejas un enfoque de purificación de proteína que produce una cantidad sustancial de la proteína diana, con el análisis de espectrometría de masas de la proteína purificada. Siguiendo este protocolo, el evento de fosforilación única de Pto se atribuyó principalmente a la Ser-198 como se ha descrito previamente 52, pero algunos espectros de espectrometría de masas también apoyó un solo evento de fosforilación en Thr-195 o Thr-199. Cuando se observaron eventos dobles de fosforilación de toma de fuerza, la combinación predominante de aminoácidos fosforilados fue Ser y Thr-198-199, aunque también se observaron combinaciones en otros sitios (Tabla 1). Estos resultados demuestran claramente la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas y la capacidad del protocolo descrito para caracterizar en detalle todos los posibles sitios de fosforilación. Los pasos más importantes de este protocolo son: 1) la extracción suficiente de proteínas, 2) la protección de los PTM, y 3) la cantidad suficiente de proteína diana. En primer lugar, para la extracción suficiente de proteínas, es importante para moler el tejido en nitrógeno líquido y, posteriormente, utilizar un homogeneizador de tejidos tal como se describe en el protocolo. Si un homogeneizador de tejidos no está disponible, un mortero y mano de mortero pueden ser utilizados. También es importante usar una relación de uno a tres (o cuatro) de gramos de tejido a volumen de tampón de extracción. Este tejido para amortiguar relación y el tampón de alta fuerza que sugerimos se asegurará de que el pH se mantendrá neutral durante el proceso de extracción. Encontramos que esto es de particular importancia para A. thaliana y tomate adicionalcciones 52. Protección de PTM se puede lograr mediante la inclusión en todos los búferes de los inhibidores adecuados de enzimas que pueden eliminar PTM. También es fundamental para llevar a cabo todos los pasos a 4 ° C y para preenfriar buffers e instrumentos. Los mayores rendimientos de proteína diana se puede lograr mediante el uso de plantas que expresan la proteína en cantidades suficientes y mediante el uso de altas cantidades de tejido (aproximadamente 20 g). El paso más importante para la obtención de cantidades suficientes de proteína diana está concentrando la proteína diana mediante inmunoprecipitación directa. La importancia de este paso es destacado por nuestra falta de identificación de PTM de Pto después de una inmunoprecipitación Prf debido a la cantidad limitada de coimmunoprecipitated Pto (Figura 2B). En contraste, la inmunoprecipitación directa de Pto. produjo péptidos sustancialmente más mensurables (Figura 2C) que conducen a aproximadamente 80% de cobertura de la secuencia de la proteína y la identificación de PTM (Tabla 1). También strongly recomendar el uso de epítopo-tags para inmunoprecipitación de proteínas. En comparación con anticuerpos producidos contra proteínas de la matriz epítopo de etiquetas de afinidad nativa puede producir cantidades más altas de proteína parcialmente purificada. Mediante el uso de un anticuerpo contra la proteína nativa Pto 51 (Figura 2) para la inmunoprecipitación, hemos sido capaces de identificar sólo la fosforilación único de los dos sitios de fosforilación predominantes de Pto. Este protocolo ha sido desarrollado principalmente para la purificación parcial de N. benthamiana proteína citoplasmática y la posterior identificación de sus sitios de fosforilación. Sin embargo, el uso de las modificaciones descritas en el presente documento, este protocolo se puede adaptar fácilmente para A. proteínas thaliana y proteínas unidas a la membrana. El principal objetivo de este protocolo es para producir suficientes cantidades de la proteína diana para la identificación de los PTM y no para lograr la máxima pureza del complejo. Si mayor purezade se requiere el complejo una segunda etapa de purificación se puede añadir a este protocolo 52. En ese caso, un primer paso permitirá a la elución de la proteína diana a partir de la matriz de afinidad sin el uso de sales de ácido o altas y la etapa posterior puede implicar una matriz, lo que requiere condiciones de elución duras. Es importante destacar que sólo hemos probado este protocolo para la identificación de sitios de fosforilación y que actualmente estamos probando su capacidad para la identificación detallada de PTM adicionales. Nuestros resultados representativos demuestran claramente la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas y la capacidad del protocolo descrito para caracterizar sitios de fosforilación. Lo más importante, ponen de relieve que la identificación de sitios de fosforilación que confían en baja cantidad de proteínas por espectrometría de masas y por mutaciones puntuales de sitios auto-fosforilación puede dar resultados confusos. Mostramos aquí y anteriormente 47 </sup&gt; Que la doble fosforilación de Pto. en Ser y Thr-198-199 se asocia con la activación del complejo PRF / Pto. En contraste, los resultados publicados anteriormente 47,63 han demostrado que las mutaciones de un solo punto de Ser-198 y Thr-199 a alanina, que impiden la fosforilación en estos sitios, son capaces de señalización lo que sugiere que la fosforilación de estos sitios no es un requisito previo para la activación compleja . Estos resultados pueden explicarse ahora por la fosforilación del sitio secundario Thr-195. Visión similar a la plasticidad sitio de fosforilación de otra proteína quinasa puede obtenerse siguiendo este protocolo. Además, un enfoque combinado usando sitios de fosforilación de mutaciones puntuales, las proteínas que pueden inhibir quinasas específicas (efectores), junto con la inmunoprecipitación de proteínas y análisis de espectrometría de masa dará lugar a una mejor comprensión de la importancia evolutiva de la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas.

Vías inmunes se basan en diferentes modificaciones post-traduccionales (PTMs) de proteínas para transducir señales rápidamente y activar respuestas inmunes 1. Las PTM se alteraciones químicas rápidos, reversibles, y altamente específicos de la estructura de proteínas que pueden afectar a la conformación de proteínas, la actividad, la estabilidad, la localización, y las interacciones proteína-proteína 2-4. En las plantas, se han identificado más de 300 tipos de PTM incluyendo ubiquitinación, la sumoilación, sulfatación, glicosilación, fosforilación y 2,5. Un creciente cuerpo de evidencia pone de relieve la importancia de la PTM en diferentes aspectos de la inmunidad planta 1,5,6. La fosforilación de proteínas, la unión reversible de un grupo fosfato a una serina, treonina o tirosina es un regulador de muchas funciones celulares y no es sorprendente el más altamente estudió PTM en defensa de la planta cascadas de señalización 5-11. De señalización dependientes de la fosforilación es una parte integral de DEFE plantaactivación NSE inició después de la percepción extracelular de microbios por los receptores transmembrana, o el reconocimiento intracelular por proteínas de resistencia multidominio 5,8. Tras la invasión de las plantas, los microbios son detectados por receptores de membrana de plasma llamados receptores de reconocimiento de patrones (RRP) 12. Parentales conocidos son o bien proteínas similares a receptor (RLP) o quinasas de tipo receptor (RLKs), tanto que lleva un ectodominio de unión a ligando y un dominio transmembrana de paso único. En contraste con los RLP, RLKs tienen un dominio de quinasa intracelular 13-15. El ectodominio de PRRS se une a moléculas con inductor microbio conservadas llamados patógenos-patrones moleculares asociados (PAMP) que conduce, en el caso de RLKs, a la autofosforilación y transfosforilación dentro del dominio intracelular 6, 16. Aguas abajo de la fosforilación inducida por la percepción de derechos y responsabilidades parentales, posterior fosforilación de las proteínas quinasas citoplasmáticas incluyendo 17, </sup&gt; 18, E3 ligasas 19, activadas por mitógenos proteína quinasa (MAPK) 20, 21, dependientes de calcio proteínas quinasas (CDPK) 22, 23, y los factores de transcripción 24, 25 lleva a la inmunidad producida PAMP (PTI). Además de la percepción extracelular por PRRS, el reconocimiento intracelular de patógenos se logra a través de receptores citoplasmáticos. Estos multidominio resistencia (R), las proteínas contienen un dominio variable N-terminal, una unión de nucleótidos-(NB) motivo central, y repeticiones ricas en leucina C-terminal (LRR) y por lo tanto denominan proteínas NB-LRR 26, 27. R proteínas directa o indirectamente reconocen moléculas de virulencia derivados de patógenos llamados efectores, también conocidos a los parentales y otros nodos del sistema inmune. Reconocimiento induce fuertes defensas que conducen a la inmunidad efectora activada por (ETI) 28-31. Proteínas NB-LRR tienen una requisiciónTE motivo de unión a ATP en el dominio NB 30, 32, pero carecen de un dominio de quinasa. La fosforilación de los dominios conservados de NB-LRR se ha informado en un estudio de proteómica a gran escala de 33, pero su relevancia para el IET no está claro. De manera similar a PTI, la activación de las proteínas NB-LRR conduce a la fosforilación de proteínas citoplásmicas incluyendo MAPKs 34-37 y 38-40 CDPKs. Lo más importante, el reconocimiento efector puede llevar a la fosforilación de proteínas accesorias que interactúan directamente con las proteínas NB-LRR 41. Algunos ejemplos incluyen RIN4 (Arabidopsis thaliana) y Pto. (tomate, Solanum lycopersicum) proteínas que interactúan con proteínas NB-LRR, RPM1 42, 43 y FRP 44, respectivamente. Durante la infección por bacterias Pseudomonas syringae, la proteína efectora AvrB induce RIN4 fosforilación, lo más probable por el receptor de la quinasa RIPK 45, <sup&gt; 46. Del mismo modo, en la P. de tomate syringae efectores AvrPto y AvrPtoB inducen la fosforilación de Pto 47. En contraste con RIN4 que carece de un dominio quinasa y debe ser trans-fosforilado, PTO es una quinasa activa capaz de auto-fosforilación 48 y trans-fosforilación de los sustratos 49, 50. Mientras Pto requiere su actividad quinasa para la iniciación efector dependiente de la señalización, los mutantes Pto-quinasa muertos siguen siendo capaces de señalar de manera efector independiente 51. Le explicamos recientemente estas observaciones al demostrar que el complejo Prf / Pto es oligomérica, que contiene múltiples Prf y Pto moléculas de 52 y que las moléculas Pto dentro del mismo complejo se trans-fosforilar entre sí 47. Hemos propuesto un modelo en el que una molécula de Pto (sensor) interactúa con las proteínas efectoras, provocando un cambio en la conformación de la proteína NB-LRR (PRF), que a su vez activa una segunda molécula Pto (ayudante) ingeniohin complejo. Posteriormente, el ayudante Pto molécula de trans-fosforila el sensor Pto conduce a la activación completa de la resistencia compleja 47. Estos ejemplos demuestran que la identificación de los componentes de complejos inmunes y sus posibles PTM a partir del reconocimiento de efectos puede conducir a una mejor comprensión de cómo las señales son transducidas de la percepción de efector a objetivos de abajo. Aquí se describe un método de purificación de proteínas por proteínas NB-LRR-que interactúan y la posterior identificación de sus PTM. Utilizamos Nicotiana benthamiana y el complejo de tomate Prf / Pto como modelo, pero el mismo protocolo se puede aplicar fácilmente a RLKs de N. benthamiana y A. 53 thaliana con pequeñas modificaciones como se describe en el protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

Las plantas se adaptan rápidamente a los cambios del entorno, debido a la elaboración de la percepción y señalización. Durante el ataque de patógenos, las plantas responden rápidamente a la infección a través del reclutamiento y la activación de complejos inmunes. La activación de los complejos inmunes se asocia con modificaciones post-traduccionales (PTMs) de proteínas, tales como la fosforilación, glicosilación, ubiquitinación o. La comprensión de cómo son coreografiados estos PTM dará lugar a una mejor comprensión de cómo se logra la resistencia. Aquí se describe un método para la purificación de proteínas con repeticiones ricas en leucina-nucleótidos vinculante (NB-LRR)-que interactúan las proteínas y la posterior identificación de sus modificaciones post-traduccionales (PTMs). Con pequeñas modificaciones, el protocolo se puede aplicar para la purificación de otros complejos de proteínas de la planta. El método se basa en la expresión de una versión epítopo de etiquetado de la proteína de interés, que posteriormente se purificó parcialmente By la inmunoprecipitación y se somete a espectrometría de masas para la identificación de proteínas que interactúan y PTM. Este protocolo demuestra que: i). Los cambios dinámicos en PTM tales como la fosforilación pueden ser detectados por espectrometría de masas; ii). Es importante tener cantidades suficientes de la proteína de interés, y esto puede compensar la falta de pureza de la inmunoprecipitado; iii). Con el fin de detectar PTM de una proteína de interés, esta proteína tiene que ser inmunoprecipitada para obtener una cantidad suficiente de proteína.

Se describe aquí un protocolo para la purificación de proteínas etiquetadas de estable transgénico A. thaliana líneas o después de la expresión transitoria de proteínas en N. benthamiana. Como se ilustra en la Figura 1 la purificación de la proteína objetivo está acoplada con espectrometría de masas para permitir la identificación de proteínas que interactúan y los PTM de la proteína objetivo. El protocolo ha sido diseñado para la purificación de las proteínas implicadas en la inmunidad planta y la identificación de sus PTM, pero puede ser aplicado a la purificación de cualquier proteína vegetal etiquetados. Como ejemplo usamos la purificación del complejo Prf / Pto de N. benthamiana. El N. transgénico line benthamiana 38-12 54, que expresa 35S: Pto, fue transitoriamente transformado con 35S: Prf-FLAG y el complejo fue immunoprecipitated con anti-FLAG M2 de agarosa (Figura 2A). El immunoblots (IB) de la Figura 2Ailustran que la mayoría de la proteína objetivo (FRP), se inmunoprecipitaron. Toma de fuerza y la proteína efectora interactuar AvrPtoB se copurified con FRP y detectarse utilizando anticuerpos y análisis de espectrometría de masas (Figuras 2A y 2B). Se encontró que el Pto que copurified con Prf migró más lentamente en gel de SDS-PAGE cuando coexpressed con el efector construye 35S: AvrPto y 35S: AvrPtoB (Figura 2A). Ambas proteínas efectoras inducidas más lenta la migración de la Pto. PRF-interacción (Figura 2A). Este efector reconocimiento dependiente de lenta migración de Pto. fue atribuido previamente a la fosforilación, ya que podría ser eliminado por tratamiento con fosfatasa 44. Para detectar los sitios de fosforilación que contribuyen a la lenta migración de Pto, hemos sometido el copurifying Prf Pto de análisis de espectrometría de masas. A pesar de la alta expresión de Pto y su fácil detección con inmunoblots podríamos recuperar péptidos covering sólo el 57% de la secuencia de Pto y no han identificado sitios de fosforilación (Figura 2B). Posteriormente, cambiamos las estrategias para orientar la proteína Pto con anti-FLAG. N. plantas benthamiana WT fueron transitoriamente transformadas con 35S: PRF-3HA y 35S: Pto-FLAG, con o sin 35S: AvrPto y 35S:. AvrPtoB La cantidad total de proteína por toma, que comprende tanto acomplejado Prf la y las formas libres, fue inmunoprecipitada con anti-FLAG M2 de agarosa y se sometió a fraccionamiento de SDS-PAGE, en-gel de la digestión tríptica y análisis de espectrometría de masas (Figura 2C). Con este enfoque se identificaron péptidos Pto abarcan aproximadamente el 80% de su secuencia y una interacción proteína desconocida 100 kDa. Hemos identificado un conjunto de sitios individuales y dobles de fosforilación de péptidos 187-202 y 188-202 Pto (Tabla 1). Ser-198 y Thr-199 fueron los sitios de fosforilación predominantes pero aparte phoTambién se detectaron sitios sphorylation (Tabla 1). Lo más importante es doble fosforilación en Ser-198 y Thr-199 fue identificado solamente en la presencia de cualquiera de las proteínas efectoras (Tabla 1). Recientemente hemos identificado un conjunto similar de sitios de fosforilación Pto e ilustró la importancia del evento de doble fosforilación para la señalización 47. Siguiendo el protocolo descrito aquí hemos sido capaces de identificar los cambios dinámicos en el estado de fosforilación de la proteína diana. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> Figura 1. Diseño experimental general. La proteína diana para la inmunoprecipitación (IP) se etiqueta y se expresa en planta, transitoriamente en Nicotiana benthamiana o de forma estable en Arabidopsis thaliana. Después de la extracción de proteínas de laproteína diana se inmunoprecipitó con una matriz de afinidad. Las proteínas se separaron en un gel de acrilamida por electroforesis. Gel bandas se escindieron. Las proteínas se extraen de las bandas de gel y se sometieron a espectrometría de masas. Se identifican los sitios de fosforilación y proteínas que interactúan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> Figura 2. Prf y Pto inmunoprecipitación. A). El constructo 35S: PRF-FLAG se expresó transitoriamente en línea (38-12 35S: PTO) junto con el vector vacío (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB. Tres días después de la infiltración Prf se immunoprecipitated utilizando matriz de afinidad anti-FLAG. ImmuSe realizaron noblots (IB) para Prf, AvrPtoB y Pto. Como se ha señalado por las flechas en la parte inferior del panel de inmunoblot Pto, AvrPto y AvrPtoB inducen una migración lenta de Pto. B). El constructo 35S: PRF-FLAG se expresó transitoriamente en línea (38-12 35S: PTO) junto con el vector vacío (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB. Tres días después de la infiltración de PRF se inmunoprecipitó usando agarosa anti-FLAG y se separó en SDS-PAGE. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie coloidal (CCBB) y el Prf visible, toma de fuerza y ​​AvrPtoB proteínas bandas fueron extirpados del gel y se analizaron por espectrometría de masas. La cobertura péptido porcentaje de secuencias Pto y Prf identificados por espectrometría de masas se indica. C). Las construcciones 35S: PRF-3xHA y 35S: Pto-FLAG se expresaron transitoriamente junto con 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto o vector vacío (EV) en N. benthamiana. Tres días después de la infiltración de la cantidad total dePto-FLAG se immunoprecipitated utilizando anti-FLAG agarosa y se resolvieron en SDS-PAGE. El Pto visible y Pto-que interactúan las bandas de proteínas fueron extirpados del gel y se analizaron por espectrometría de masas. Pto y la banda de proteína de 100 kDa Pto-que interactúan son claramente visibles en el coloidal Coomassie azul brillante (CCBB) de gel de colores, mientras que el PRF es un poco menos visible (como indican las flechas). IP: inmunoprecipitación; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant coloración azul; CCBB: coloidal Coomassie Brilliant tinción azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Prf </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> Péptido Pto 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [p T 195] HLSTVVK </td><td&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> Péptido Pto 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [p T 199] VVK </td&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Los péptidos 187-202 y 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Porcentaje de péptidos con dos eventos de fosforilación </td><td> 0% </td><td> 26.9% </td><td> 11,2% </td></tr><tr><td> Cobertura Secuencia Pto </td><td> 78% </td><td> 79% </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> Tabla 1 doble fosforilación de un péptido Pto tras la activación de la señalización 35S:.. Prf-3xHA y 35S: Pto-FLAG se expresaron transitoriamente junto con empty vectoriales (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB en N. benthamiana. Tres días después de la infiltración de la cantidad total de proteína Pto-FLAG se immunoprecipitated utilizando matriz de afinidad anti-FLAG y se resolvió en SDS-PAGE. Las bandas visibles de Pto del coloidal Coomassie brillante gel teñido con azul se extrajeron y analizaron con espectrometría de masas. Se indica el número de péptidos identificados Pto con 0, 1, y 2 eventos de fosforilación. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tabla de tampones </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio L </td><td> Triptona </td><td> 10 g / l </td></tr><tr><td></td><td> Extracto de levadura </td><td> 5 g / l </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 g / l </td></tr><tr><td></td><td> D-glucosa </td><td> 1 g / L </td></tr><tr><td> Tampón de Agro-infiltración </td><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Ajustar el pH a 5,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetosiringona (opcional) </td><td> 150 M </td></tr><tr><td> Tampón A </td><td> Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glicerol </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Tampón B </td><td> Tampón A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> Tampón C </td><td> Tampón B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Inhibidor de la proteasa cóctel Plant </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) </td><td> 0,5 mM </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin </td><td> 50 nM </td></tr><tr><td></td><td> El fluoruro de sodio (NaF) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td></td><td> Molibdato de sodio (Na 2 Moo 4) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Ortovanadato de sodio </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td></td><td> Ácido ocadaico </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Tampón D </td><td> Tampón C sin PVPP </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de carga 5x SDS-PAGE </td><td> Tris-HCl, pH 6,8 </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2% </td></tr><tr><td></td><td> Glicerol </td><td> 0,15% </td></tr><tr><td></td><td> Azul de bromofenol </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td></td><td> TDT (añadir justo antes de su uso) </td><td> 50 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Buffer y las recetas de los medios.

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Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Se describe aquí un protocolo para la purificación y caracterización de complejos de proteínas vegetales. Demostramos que por immunoprecipitating una sola proteína dentro de un complejo, para que podamos identificar sus modificaciones posteriores a la traducción y sus socios que interactúan.

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K vistas.  University of Warwick.  Se describe aquí un protocolo para la purificación y caracterización de complejos de proteínas vegetales. Demostramos que por immunoprecipitating una sola proteína dentro de un complejo, para que podamos identificar sus modificaciones posteriores a la traducción y sus socios que interactúan. 

Video: Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Investigación

Biología

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

La detección de modificaciones post-traduccionales de los nativos intactos nucleosomas por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

La detección de modificaciones de las histonas en hojas de las plantas

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...