The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

1. Construcción de vectores de expresión <ol><li> Uso PCR Infusión de clonación para la construcción de hasta 96 plásmidos de expresión en paralelo usando los vectores pOPINE-3C-GFP y pOPIN-N-GFP que añadir ya sea fusiones GFP-His6 C-terminal o N-terminal de las secuencias escindibles a 13 respectivamente. Nota: La elección del vector viene dictada por la topología de la proteína ya que el GFP necesita ser expresado en el citosol, por lo tanto para una proteína citosólica con un N-terminal y C-terminal extracelular usaríamos pOPIN-N-GFP y para un N-terminal extracelular y citosólica C-terminal en que usarían pOPINE-3C-GFP. Cuando ambos terminales son citosólica usaríamos pOPINE-3C-GFP menos que haya motivos funcional no etiquetar el C-terminal. </li><li> Amplificar las secuencias de ADN que codifican las proteínas de la membrana con cebadores que incorporan las siguientes extensiones mostrados: pOPINE-3C-GFP (Cebador directo - AGGAGATATACCATG; cebador inverso - CAGAACTTCCAGTTT) y pOPIN-N-GFP (Cebador directo - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; cebador inverso - ATGGTCTAGAAAGCTTTA). </li><li> Analizar la reacción de PCR por electroforesis en gel de agarosa. Una vez que los productos de PCR limpios se han obtenido, añadir 5 U DpnI a cada pocillo (maquillaje en 5 l de tampón de reacción 1x DpnI). Purificar los productos de PCR utilizando perlas magnéticas en un formato de 96 pocillos. Nota: Dpnl se añade para eliminar el vector de la plantilla; este paso no es necesario si se usa ADN genómico como plantilla. </li><li> Añadir 1 l (100 ng) del vector linealizado apropiado a cada pocillo de una placa de PCR. </li><li> Utilizando una pipeta multicanal add x l de PCR purificado insertar a los pocillos apropiados de la placa de PCR. Asegúrese de que todos los productos están en el rango de 10 a 250 ng. </li><li> Añadir (9-x) l de agua al pozo y transferir toda la 10 l a un tubo que contiene el reactivo seco-en-fusión. Dejar durante 30 seg. </li><li> Mezcle el contenido brevemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Transferencialas reacciones de vuelta a la placa de PCR original y el sello. </li><li> Incubar durante 30 minutos a 42 ° C en un termociclador. </li><li> Transferir inmediatamente las reacciones de hielo tan pronto como se completa la reacción y añadir 40 l de TE (10 mM Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM). </li><li> Congelar a la vez o se transforman en células competentes. Para la transformación, utilice 3 l de la reacción diluida por cada 50 l alícuota de alta competencia (&gt; 5 x 10 9 transformantes / mg) E. competente células de E. coli. </li><li> Añadir 1 ml de agar LB suplementado con 50 g / ml de carbenicilina por pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos (para la clonación, preparar pocillos durante 2 x número de construcciones). </li><li> Tras consecuencia, Después de placa de derivación a cabo 25 l y 25 l de un 1 en 5 dilución del cultivo sobre el agar que contiene 24 pocillos de cultivo de tejidos. </li><li> Difundir las células inclinando suavemente la placa. </li><li> Secar la placa con la tapa durante 10-15 minutos a 37 ° C o en un flow campana a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva a colocar la tapa y gire la placa boca abajo y se incuba durante la noche a 37 ° C. </li><li> Escoja dos colonias y mini-preparación de los vectores. </li><li> PCR verificar las construcciones utilizando el cebador inverso específico de constructo y un cebador directo específico vector (por ejemplo pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG). </li></ol> 2. Transformación de E. E coli cepas xpression Nota: Antes de realizar este protocolo, E. células competentes de E. coli se hacen, alícuotas y se almacenaron congeladas a -80 ° C como se ha descrito previamente 13. Expresión de la proteína de membrana se tamiza de forma rutinaria en dos cepas, Lemo21 (DE3) y C41 (DE3) pLysS. Para ayudar a la interpretación de los resultados puede ser útil para incluir un control positivo, por ejemplo, un plásmido que expresa GFP o una proteína de membrana fusionado a GFP conocido para expresar y un control negativo vector vacío. <ol><li> Descongele la aliquotted E. coli en hielo. Añadir 3 l de plásmido de expresión de mini-preparada a cada alícuota de células competentes. </li><li> Se incuba la mezcla en hielo durante 30 min. </li><li> De choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Permitir que las células se recuperen en hielo durante 2 min y luego se añaden 300 l de caldo de potencia a cada tubo. </li><li> Incubar durante 1 hora en un incubador estático 37 ° C. </li><li> Preparar el LB agar en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, suplementado con 50 mg / ml de carbenicilina y 35 mg / ml de cloranfenicol. Añadir ramnosa a una concentración final de 0,25 mM a los pocillos que contienen Lemo21 (DE3). Nota: Si el producto es probable que sea tóxico los pocillos que contienen C41 (DE3) pLysS se puede complementar con 1% (w / v) de glucosa. </li><li> Transferencia de 30 l de células de la mezcla de transformación sobre las placas de LB agar. Corre y seque la placa como se describe en 1.13 a 1.15. </li></ol> 3. Preparación de cultivos iniciadores durante la noche Nota: Siempre preparar cultivos de la noche el día después de la transformación nunca de una placa de transformación de edad. <ol><li> Añadir 0,7 ml de caldo de potencia a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de pozo profundo suplementado con 50 mg / ml de carbenicilina y 35 mg / ml de cloranfenicol. Añadir ramnosa a los pocillos que contienen Lemo21 (DE3) a una concentración final de 0,25 mM. Opcionalmente, complementar C41 (DE3) pLysS con 1% (w / v) de glucosa; ver más arriba (2,6 de nota). </li><li> Elige una colonia de las placas de transformación durante la noche en cada pocillo. Sellar el bloque con una junta de gas-permeable. </li><li> Agitar el bloque a 250 rpm en una incubadora con una gran banda (por ejemplo, una órbita 25 mm) o al 600 rpm en una incubadora con una pequeña banda (por ejemplo, una órbita 4,3 mm) a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 4. Crecimiento e inducción de las Culturas <ol><li> Añadir 3 ml de caldo de potencia suplementado con 50 mg / ml de carbenicilina y 35 mg / ml de cloranfenicol a cada well de 24 pocillos placa de pozo profundo. Añadir L-ramnosa (y glucosa) como se describe en el apartado 3.1. Usar 3 ml de cultivo para permitir la recolección por duplicado y para permitir cierta evaporación del agua a través del sello permeable al gas. </li><li> Configure los cultivos de expresión mediante la adición de 150 l de Lemo21 (DE3) o C41 (DE3) pLysS cultivos de una noche a cada pocillo de los bloques 24 y pozos profundos. </li><li> Agitar los bloques a 37 ° C hasta que la DO promedio a 595 nm es ~ 0.5 a través de la placa. </li><li> Inducir la expresión mediante la adición de IPTG a los cultivos a una concentración final de 1,0 mM IPTG. </li><li> Cultivar las culturas durante la noche (18-20 h) con agitación a 20 ° C. </li></ol> 5. Análisis de Expresión por In-gel Fluorescencia <ol><li> Cosecha por duplicado. Transferir 1 ml de la cultura de cada pocillo en un pozo cuadrado, fondo cónico, bloque de pozo profundo de 96 pocillos. Nota: Cosecha por duplicado en caso de rotura del bloque o para permitir la prueba de un alternatihe detergente si lo desea. </li><li> Sellar los bloques y recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min. </li><li> Invierta el bloque y decantar los medios de comunicación. Toque en el bloque con cuidado sobre una toalla de papel para drenar residuos de medios. </li><li> Sellar las placas y almacenar a -80 ° C durante un mínimo de 20 min. Opcionalmente, deje el experimento en este punto y el bloque de procesado cuando sea conveniente. </li><li> De-heladas las pastillas durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Utilice una pipeta multicanal o un agitador orbital (1000 rpm durante 10 min) a 4 ° C para resuspender las células completamente en 200 l de tampón de lisis (50 mM NaH 2 PO 4, NaCl 300 mM mM de imidazol 10 1% v / v de Tween 20, ajustar el pH a 8,0 usando NaOH). </li><li> Añadir 20 l de la solución DLPI (20 l ADNasa I (4000 unidades / ml), 20 mg de lisozima, y ​​20 l de cóctel inhibidor de proteasa en un volumen final de 2 ml de agua). Incubar durante 10 min con agitación (~ 1000 rpm) a 4 ° C. </li><li&gt; Añadir 25 l de 10% n dodecil β-D-maltósido (DDM). </li><li> Incubar durante 60 min con agitación (~ 1000 rpm) a 4 ° C. </li><li> Se centrifuga el bloque de pozo profundo a 6.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transferencia de 10 l de la lisado aclarado a una placa de microtitulación y añadir 10 l de tampón de carga SDS gel PAGE (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% w / v SDS, 0,2% w / v azul de bromofenol, 10% v / v β mercaptoetanol, y 20% v / v de glicerol). PRECAUCIÓN! No hierva el MUESTRA. </li><li> Cargar 10 l de muestra de la etapa 5.11 / pocillo sobre gel SDS PAGE (s) y ejecutar a 100-120 V (voltaje constante) en una habitación fría hasta que el frente de colorante llega a la parte inferior (2-2,5 h). </li><li> Colocar el gel en un generador de imágenes (por ejemplo, con un filtro de luz azul para detectar las proteínas de fusión GFP). Se elige el tiempo de exposición para asegurar que las bandas más brillantes no están saturados. </li></ol> 6. La ampliación de los cultivos celulares <ol><li> Transformar una alícuota de competente <em&gt; E. coli como se describe en la sección 2. </li><li> Elija una colonia en 10 ml de caldo de potencia (complementado como se describe en la sección 3) y crecer durante la noche a 37 ° C. </li><li> Diluir 5 ml del cultivo durante la noche en caldo de potencia 500 ml. </li><li> Crecer con agitación a 250 rpm a 37 ° C hasta que la DO a 595 nm es de ~ 0,5. </li><li> Inducir la expresión mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1,0 mM. </li><li> Crecer durante la noche con agitación a 250 rpm a 20 ° C. </li><li> Cosecha células por centrifugación a 5000 xg durante 15 min. </li><li> Sobrenadante Descartar. Los sedimentos celulares se pueden almacenar a -80 ° C. </li></ol> 7. Preparación de Membranas <ol><li> Descongelar las células (si es necesario) a temperatura ambiente y resuspender en 1x PBS pH 7,5 a un volumen de 5 ml por gramo de sedimento celular; Aumentar el volumen como sea necesario hasta que la viscosidad se reduce a una consistencia líquida. Añadir MgCl 2 a una concentración final de 1 mM, DNAsa I a concentración final de 10 mg / ml y unopre-envasados ​​proteasa tableta de inhibidor por 20 g de sedimento celular. Romper las células abiertas usando un disruptor celular refrigerada a una presión de 30 kpsi. </li><li> Sedimentar las células intactas y los desechos a 30.000 g durante 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de ultra-centrifugación. </li><li> Recoger la fracción de membrana total desacelerándose el sobrenadante en un ultra-centrifugar a 200.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento de membranas en agua helada 10 ml de PBS pH 7,5 usando un homogeneizador celular. Se requiere 1 ml membranas resuspendidas para cada detergente. Opcionalmente, en esta etapa, flash congelar la suspensión de membrana en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 8. solubilización y Análisis de la fracción de membrana <ol><li> Fracción de membrana deshielo (si es necesario), y para cada detergente a utilizar para la solubilización, alícuotas 900 l de la suspensión de membrana en un 1,5 ml polialómero micro-centrifutubo ge. </li><li> Añadir 100 l de cada detergente recién preparado (10% w / v soluciones de DDM, DM, cimal-6 y LDAO) a una concentración final de 1% al tubo de 1,5 ml especificado. Para la solubilización de proteínas de membrana eucariota hemisuccinato de colesterol (concentración final 0,2%) se puede añadir a los detergentes. </li><li> Incubar las mezclas a 4 ° C durante 1 hora con agitación suave. </li><li> Sedimentar la fracción insoluble detergente con un banco de la parte superior ultra-centrífuga, tubos, lo que garantiza al menos medio lleno, en 150.000 g a 4 ° C durante 45 min y retener sobrenadante. Nota: La eficacia de solubilización de detergente se puede estimar usando un lector de placas fluorescente mediante la medición de la fluorescencia de GFP de las membranas solubilizadas con la fracción insoluble detergente se resuspendieron en el mismo volumen de PBS. </li><li> Analizar el mono-dispersidad de los diferentes detergentes: complejos de proteínas de membrana utilizando cromatografía de exclusión por fluorescencia detectada (FSEC). </li><li> Para el análisis FSEC, equilibrar una columna de exclusión de tamaño con una amplia gama de fraccionamiento, por ejemplo, 5.000 a 5.000.000 de peso molecular, con el funcionamiento de tampón (20 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,03% DDM) a una velocidad de flujo de 0,3 ml / min . Utilice este tampón para todas las muestras, es decir, no se cambia para cada detergente probado. </li><li> Inyectar 100 l de membranas solubilizadas en la columna a un caudal de 0,3 ml / min. Monitorear perfil de elución usando la óptica de fluorescencia (excitación a 488 nm y emisión a 512 nm). Si un monitor de fluorescencia en línea no está disponible, recoger las fracciones y leer la fluorescencia en un lector de placas. </li><li> Volumen de elución de importación y los datos de intensidad de fluorescencia en un programa de hoja de cálculo para la visualización gráfica. </li><li> Analizar restante material de la membrana solubilizada por fluorescencia de gel como se describe en la sección 5. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

En el protocolo descrito en este artículo, la ligadura de la clonación en un vector independiente reportero GFP se combina con detección de fluorescencia para detectar rápidamente la expresión relativa de múltiples proteínas de la membrana en E. coli. Los vectores se pueden hacer en cuatro días de trabajo con expresión de cribado primario de tomar una semana más. En-gel fluorescencia de lisados ​​detergentes de células enteras se utiliza para clasificar expresión golpea para su posterior análisis en una pantalla secundaria. La pantalla de expresión primaria tal como se presenta no requiere ningún equipo especializado, aparte de un incubador agitador adecuado para el cultivo de células en bloques de pocillos profundos. Todas las otras manipulaciones líquido en la que placas de 96 pocillos SBS puede llevarse a cabo utilizando pipetas multicanal. El protocolo puede modificarse fácilmente para incluir otras cepas de E. coli cultivadas bajo diferentes condiciones de expresión (por ejemplo, temperatura baja). En el caso de la LEMO21 (DE3) titulando el nivel de ramnosa (de 0 a 2,0 mM)añadido para modular la tasa de transcripción puede aumentar el nivel de expresión de algunas proteínas de la membrana 7. Detergentes distintos de DDM podrían ser utilizados para la extracción en la pantalla primaria aunque detergentes más duras pueden solubilizar proteínas a partir de cuerpos de inclusión y por lo tanto dar falsos positivos. Es evidente que la más elaborada la pantalla inicial se convierte, el tiempo del experimento más. La pantalla secundaria implica la preparación de una fracción de membrana total a partir de los éxitos de expresión identificados en la pantalla primaria. Este es un paso crítico, ya que confirmar la localización de las proteínas de fusión a la membrana de la E. células de E. coli. La extracción subsiguiente de la proteína de fusión GFP en diferentes detergentes se controla por el tamaño de cromatografía de exclusión por fluorescencia detectada del material solubilizado para evaluar la mono-dispersidad de los complejos proteína-detergente. Este es otro paso importante, ya que identifica el detergente más adecuado parasolubilización de la proteína de membrana para el procesamiento aguas abajo subsiguiente. Sin embargo, la experiencia demuestra que una mayor optimización de la selección del detergente (s) puede ser necesaria durante la purificación y cristalización. Evidencia de un comportamiento uniforme en diferentes detergentes incluidas las micelas con un tamaño relativamente pequeño (por ejemplo, LDAO) parece ser un buen indicador de la propensión a formar así cristales de difracción por lo menos para las proteínas de membrana procariotas 14. En este sentido, el perfil se muestra para la proteína de la membrana en la Figura 2B aparece altamente favorable. La principal ventaja de utilizar un reportero GFP es que da una rápida lectura de expresión en muestras sin purificar. Una desventaja es que la proteína de fusión GFP tiene que ser eliminado durante la purificación de la proteína para la cristalización. En el caso de los vectores utilizados aquí, un sitio de proteasa 3C de rinovirus permite la escisión de la GFP. Alternativamente, es sencillopara volver a clonar proteínas candidatos, identificados en la pantalla, en vectores que sólo añaden una polihistidina u otro marcador de afinidad para la purificación posterior. Esto supone que la fusión a GFP no es necesaria para la expresión. La principal alternativa al uso de la fusión a GFP para la detección de la expresión de proteína de membrana y solubilización es añadir sólo una etiqueta de histidina. Sin embargo, este enfoque requiere típicamente a partir de una fracción de membrana 15 que para la evaluación de muchas variantes se convertiría consume mucho tiempo. En resumen, el objetivo principal del protocolo descrito en este artículo es para permitir que un gran número de secuencia de la proteína de membrana variantes de ser evaluado rápidamente en términos de expresión y solubilización de detergente y priorizado para el análisis más profundo.

Se ha estimado que las proteínas de membrana representan aproximadamente el 20-30% de los genes codificados en todos los genomas secuenciados 1, incluyendo el genoma humano 2. Dado su papel fundamental en muchos procesos biológicos, por ejemplo, el transporte de metabolitos, generación de energía y como dianas de medicamentos, hay un gran interés en la determinación de su estructura tridimensional. Sin embargo en comparación con las proteínas solubles, proteínas de membrana son muy poco representadas en el Protein Data Bank. De hecho, de las 99.624 estructuras liberadas en el AP ( <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) sólo 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) se clasifican como proteínas de membrana. Esto refleja las dificultades técnicas de trabajar con proteínas de membrana que se expresan naturalmente en niveles relativamente bajos; rodopsina es una de las pocas excepciones 3,4. La sobreexpresión de la versión recombinantes en células heterólogas a menudo resulta en mal plegamiento y la mala orientación a la membrana que limita el nivel global de producción. Seleccionar el mejor detergente para la extracción y solubilización de una proteína de membrana, una vez expresada hace posterior purificación difícil y requiere la optimización cuidadosa. Escherichia coli sigue siendo el huésped de expresión más comúnmente utilizado para proteínas de membrana que representan el 72% ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) de las estructuras resuelto hasta la fecha, que son casi exclusivamente a partir de fuentes bacterianas. Específico E. cepas de E. coli, C41 (DE3) y C43 (DE3), se han aislado que no conducen a la sobreexpresión de proteínas de la membrana y por lo tanto evitar los efectos de la toxicidad observada en otros BL21 cepas de 5,6. Ajuste del nivel de expresión de proteína de membrana recombinante parece ser crítica para optimizar el nivel de producción de 6,7. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; En muchos casos, la producción exitosa de proteínas de membrana para la determinación de la estructura ha requerido la evaluación de varias versiones incluyendo amino y deleciones carboxi-terminal, múltiples orthologues para explotar variación de la secuencia natural y diferentes proteínas de fusión 6.8. Por lo tanto, un método para la detección expresión de múltiples proteínas de la membrana en paralelo es esencial. Un enfoque comúnmente utilizado es fusionar la proteína a proteína verde fluorescente (GFP) de expresión que permite realizar un seguimiento sin la necesidad de purificar la proteína. De esta manera, la información sobre el nivel de expresión, la estabilidad y el comportamiento en diferentes detergentes se puede evaluar con pequeñas cantidades de material sin purificar 9-12. En este artículo se describe un protocolo eficiente para la detección de clonación y expresión de proteínas de membrana en E. coli usando la fusión de GFP como reportero de la producción y la posterior caracterización de detergente: borrador proteínaReflejos (Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPIN-N-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPINE-3C-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C41(DE3)pLysS</td>
			<td>Lucigen (http://lucigen.com/</td>
			<td>60444-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEMO21(DE3)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2528H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td>
			<td>Clontech/Takara</td>
			<td>639688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power broth</td>
			<td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td>
			<td>MD12-106-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&#946;-D-Maltoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM ( n-Dodecyl &#223;-maltoside )</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D97002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (n-Decyl &#223;-maltoside)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D99003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D71111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>4672030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200&#181;L LTS Spacer</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>LA6-300XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20&#181;L LTS</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-20XLSPLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200&#181;L LTS Tip</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-1200XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well V bottom deep well blocks</td>
			<td>Porvair sciences</td>
			<td>360115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5928</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WG1203BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WR0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibramax 100</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-21200-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tension rollers attachment</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>549-81000-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393253</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs</td>
			<td>Shel Lab&#160;</td>
			<td>SSI5R-HS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova44R incubator</td>
			<td>New Brunswick /Eppendorf</td>
			<td>Innova44R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI)</td>
			<td>Constant systems</td>
			<td>PL083016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli

La producción de proteínas de membrana recombinantes para estudios estructurales y funcionales sigue siendo técnicamente difícil debido a los bajos niveles de expresión y la inestabilidad inherente de muchas proteínas de la membrana una vez solubilizado en detergentes. Un protocolo se describe que combina la ligadura de la clonación independiente de proteínas de membrana como fusiones de GFP con la expresión en Escherichia coli detectadas por fluorescencia de GFP. Esto permite la detección de la construcción y expresión de la proteína de la membrana múltiple / variantes para identificar candidatos adecuados para una mayor inversión de tiempo y esfuerzo. El reportero GFP se utiliza en una pantalla primaria de expresión mediante la visualización de la fluorescencia de GFP después de la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Las proteínas de membrana que muestran tanto un alto nivel de expresión con un mínimo de degradación como se indica por la ausencia de GFP libre, se seleccionan para una pantalla secundaria. Estas construcciones se escalan y una fracción total de membrana preparada y solubilizard en cuatro detergentes diferentes. Después de la ultracentrifugación para eliminar el material insoluble en detergente, los lisados ​​se analizaron por cromatografía de exclusión de tamaño de detección de fluorescencia (FSEC). Monitorización del perfil de exclusión de tamaño por la fluorescencia de GFP proporciona información sobre el mono-dispersidad y la integridad de las proteínas de membrana en diferentes detergentes. Proteína: combinaciones de detergente que eluyen con un pico simétrico con poca o ninguna libre de GFP y la agregación mínima son candidatos para la posterior purificación. Utilizando la metodología anterior, la expresión heteróloga en E. Se analizó coli de SED (forma, el alargamiento, la división y la esporulación) proteínas de 47 especies diferentes de bacterias. Estas proteínas tienen típicamente diez dominios transmembrana y son esenciales para la división celular. Los resultados muestran que la producción de los SED orthologues en E. coli fue muy variable con respecto a los niveles de expresión y la integridad de las proteínas de fusión GFP. El i experimentodentified un subconjunto para una mayor investigación.

La familia SEDS de proteínas (forma, elongación, división, y esporulación) es esencial para la división celular bacteriana. Estas proteínas integrales tienen típicamente diez dominios transmembrana con ambos extremos amino y carboxilo dentro de la célula. Para ejemplificar el protocolo descrito anteriormente, 47 SED orthologues se clonaron en el vector pOPINE-3C-eGFP. Una pantalla de expresión a pequeña escala de las construcciones se llevó a cabo en dos cepas .coli E, Lemo21 (DE3) cultivadas en la presencia de 0.25 mM ramnosa para bloquear la expresión fugas y C41 (DE3) pLysS, que se utilizan de forma rutinaria para la expresión de membrana proteínas 5-8. Solubilizados con detergente lisados ​​de cultivos inducidos se analizaron mediante electroforesis en SDS-poliacrilamida. El uso de la fluorescencia en gel para visualizar proteínas de fusión GFP expresadas mostraron que se produjeron entre las dos cepas 38 de los 47 SED construcciones. Curiosamente hubo diferencias entre las dos cepas de expresión. De los 38 expresaron construcciones, sólo 18 fueron producidos en ambas cepas, 14 sólo se expresa en Lemo21 (DE3) y 6 sólo en C41 (DE3) pLysS. En general, hubo una mayor tasa de éxito para la Lemo21 (DE3) en comparación con el pLysS C41 (DE3) (38 vs 24). Sin embargo, la observación de que algunas proteínas parecen ser específicos cepa significa que el cribado en tanto es útil. Los datos representativos para 24 de los 47 SEDs constructos se muestran en la Figura 1. La intensidad de las bandas da una indicación del nivel de expresión, por ejemplo, la proteína de fusión en C4 bien en la figura 1A y 1B se expresa bien en ambas cepas sin embargo, la adicional bandas de menor peso molecular sugieren que la proteína es parcialmente degradada. En muchos carriles hay una banda que corresponde en tamaño a GFP solo. Una evaluación cualitativa de la integridad de la proteína puede llevarse a cabo mirando a la intensidad de la proteína de fusión con respecto a la GFP libre;por ejemplo, G4 y H4 están completamente descompuestos a GFP libre en C41 (DE3) pLysS (Figura 1B), mientras que en el Lemo21 (DE3) hay algo de proteína intacta (Figura 1). Para 14 de los 38 proteínas expresadas de la intensidad de la banda de GFP libre es similar a la de la proteína de fusión, para 21 la intensidad de la banda de GFP libre es mayor que la de la proteína de fusión y una minoría de las proteínas de fusión (3 / 38 expresado), por ejemplo F6 y G6 en la Figura 1A tener relativamente poco GFP libre en comparación con la proteína de fusión. Dos de las construcciones que expresan bien en los B5 pantalla principal (bandas de alta intensidad para GFP libre y proteínas de fusión) y G6 (poco libre GFP) se expresaron y una fracción total de la membrana preparada a partir de la cultura ml celular 500. Membranas resuspendidas se dividen en alícuotas y se analizaron mediante cromatografía de exclusión por fluorescencia detectada (FSEC). Los perfiles FSEC se presentan en la Figure 2A y 2B, respectivamente, y muestran que las dos proteínas SED comportan de manera diferente en los cuatro detergentes ensayados. En un caso (Figura 2A: muestra B5) la proteína sólo dio un pico simétrico con poca agregación en DDM que sería por lo tanto el detergente de elección para la posterior purificación. Por el contrario la otra proteína de fusión (Figura 2B: muestra G6) dio un perfil similar en todos los detergentes probados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo para el cribado de la membrana expresión de la proteína en E. coli usando un reportero GFP. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> Figura 2: Pantalla primaria de expresión de proteínas de membrana mediante fluorescencia en gel. </strong&gt; lisados ​​detergentes de E. coli células fueron analizadas por SDS-PAGE y geles imágenes utilizando azul Epi iluminación y un filtro 530/28. Los resultados se muestran para 24 constructos etiquetados (A4-H6 basado en su posición en una placa de 96 pocillos). Las posiciones de las bandas para GFP y libre de proteínas de fusión GFP se indican. (A) las proteínas expresadas en Lemo21 (DE3). (B) Las proteínas expresadas en C41 (DE3) pLysS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Pantalla secundaria de la membrana de expresión de la proteína usando cromatografía de exclusión de tamaño de la fluorescencia detectada (FSEC) fracciones de membrana total se extrajeron en cuatro detergentes diferentes y las proteínas de membrana solubilizadas se analizó por cromatografía de exclusión por tamaño usando un sistema de FPLC acoplado a un detector de fluorescencia. Perfiles FSEC para (A) B5 proteína de membrana y (B) </strong&gt; G6 proteína de membrana. La posición de los picos correspondientes a la proteína agregada, solubilizado proteína de fusión GFP y GFP libre se indican. Los detergentes ensayados se indican debajo de los perfiles.

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Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Se presenta un método simplificado para la detección de la expresión de proteínas de membrana recombinantes en Escherichia coli basada en la fusión a la proteína verde fluorescente.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

green-fluorescent-protein-based-expression-screening-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

32.4K vistas.  Research Complex at Harwell.  Se presenta un método simplificado para la detección de la expresión de proteínas de membrana recombinantes en Escherichia coli basada en la fusión a la proteína verde fluorescente. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Los protocolos para la implementación de un<em&gt; Escherichia coli</emSistema&gt; Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...