Para comenzar, coloque 15 mililitros del medio de gradiente de densidad en un tubo de centrifugación de 15 mililitros y gírelo a 1.000 G durante un minuto a 20 grados centígrados. Invierta el tubo que contiene la sangre humana recolectada en heparina y, con pinzas esterilizadas contra incendios, retire la tapa del tubo de recolección de sangre. Dispense alrededor de 10 a 15 mililitros de sangre al medio de gradiente de densidad en el tubo.
Ajuste el nivel de deceleración de la centrífuga a uno y centrifuga el tubo con sangre a 1.000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire la capa superior de plasma hasta un centímetro por encima de la capa leucocitaria. Decantar el sobrenadante restante del tubo de centrifugación en otro tubo de centrífuga que contenga 10 mililitros de PBS.
Restablezca el nivel de deceleración de la centrífuga a tres y centrifuga el tubo con PBS y sobrenadante. Aspire el sobrenadante y golpee suavemente el tubo para aflojar el pellet. A continuación, incorpore 13 mililitros de medio aislante en el tubo de centrífuga y lave la pared interna para recoger las células correctamente.
Con pinzas esterilizadas contra incendios, coloque un filtro de células de 100 micrómetros en el tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, filtre la suspensión celular a través del filtro celular en el tubo cónico de 15 mililitros. Dispense cantidades iguales de suspensión celular en dos tubos cónicos de 15 mililitros.
Enumere las celdas para calcular la concentración adecuada de tampón de aislamiento. Granular las células a 250 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, añada la cantidad adecuada de tampón de aislamiento y pipetee unas 20 veces para aflojar el pellet.
