Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) SCHU-2681 / 1.1 (CS) y de KFO 146 (MF), el Departamento de Defensa DOD de subvención PC 040972 (MO) y el Instituto Nacional de Salud subvenciones RO1 CA108835 , SR1 Ai44129 (JPS)

1. Generación de HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Preparar tampón de borato estéril. Hacer una solución de ácido bórico 0,1 M en agua y ajustar el pH a 7,0. Filtro estéril (0,22 m) de amortiguación y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Preparar el tampón de lavado del grano estéril. Utilizar tampón fosfato salino (PBS) sin magnesio y calcio. Añadir suero AB humano para la concentración final del 3%. Añadir ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 2 mM de concentración final. Añadir azida de sodio (NaN 3) para la concentración final de 0,01%. Filtro estéril (0,22 m) de amortiguación y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Transferir 250 l de perlas de epoxi (unos 100 x 10 6 perlas) de caldo en un recipiente estéril, tornillo vial de vidrio superior. </li><li> Añadir 250 l de tampón de borato. </li><li> Ponga vial de vidrio en un imán y dejar que los granos se adhieren durante 2 min; tampón aspirar y eliminar vial de vidrio de imán. </li><li> Lavar una vez con perlas 1 ml de tampón de borato. </li><li> Suspender las en 550 l de 0,018 g/ Ml HLA-A2-Ig y 3,64 mg / ml CD95 MAB (clon CH11) anti-humana y mezclar suavemente por agitación. (Por favor vea la sección de discusión para obtener información adicional.) </li><li> Incubar vial de vidrio en un extremo sobre el extremo de los rotadores, a 4 ° C durante 24 horas. </li><li> Centrifugar perlas a 300 xg durante 2 min. </li><li> Coloque el vial de vidrio sobre un imán durante 2 min y aspirar la &quot;solución de carga KaAPC&quot;; eliminar vial de vidrio de imán, añadir 1 ml de tampón de lavado del grano y volver a suspender cuidadosamente por agitación. </li><li> Repita el paso 1.10 dos veces. </li><li> Incubar vial de vidrio en un rotador a 4 ° C durante 24 horas en tampón de lavado 1 del talón ml. En este punto, toda la proteína residual sitios de unión será bloqueada por el suero AB humano contenida en el tampón de lavado de perlas. </li><li> Centrifugar perlas a 300 xg durante 2 min. </li><li> Lugar ampolla de cristal en un imán para los 2 min y tampón aspirado de lavado del grano; eliminar vial de vidrio de imán y reemplazar solución con 1 ml de PBS. </li></ol> 2. Control de Calidad, Péptido Cargando, Wincineración, Almacenamiento y Estabilidad de KaAPC <ol><li> Transferir 1,5 x 10 5 KaAPC en un tubo de FACS y se lava con 1 ml de tampón de lavado FACS. </li><li> Suspender las en 100 l FACS tampón de lavado y se añade 1 l de anti-ratón IgG1 PE (para la detección de la parte Fc de la HLA-A2-Ig) y 1 l de IgM anti-ratón FITC (clon R6-60.2, para la detección del mAb anti-CD95 humano). </li><li> Incubar durante 15 min a 4 ° C, lavar con 1 ml FACS tampón de lavado y se vuelve a suspender en 250 FACS mu l de solución de lavado y leer tinción por citometría de flujo. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. QC mancha de un lote KaAPC hecho como se indica en la sección de protocolo. Tinción se realizó tal como se describe en la sección de protocolo 2. HLA-A2-Ig se detectó utilizando un PE mAb anti-ratón IgG1, mientras que los anti-humano-CD95 (anti-Fas) se detectó con un anti-ratón-FITC mAb IgM (véase el protocolo en sícción 2.2) (línea azul). Gráficos negros rellenos representan perlas vacías teñidas con anti-ratón IgG1-PE o mAb anti-ratón-FITC mAb IgM, respectivamente. Los números en la esquina superior derecha indican la intensidad media de fluorescencia (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="4"><li> Para péptido transferencia de carga 20 x 10 6 KaAPC en un nuevo vial de vidrio estéril, colocar en un imán durante 2 min, aspirado PBS y volver a suspender las bolas en 500 l de PBS fresco con 5 mg de péptido (Tenga en cuenta, sólo péptidos HLA-A2 restringidas asirse al dímero). </li><li> Tienda cargado KaAPC a 4 ° C hasta su uso, durante al menos 3 días para permitir suficiente carga péptido en el dímero HLA-A2-Ig. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, lavar el péptido cargado KaAPC como se indica en 1,14; repita este paso al menos 6 veces. NOTA: Este es un paso crucial para asegurar que el péptido libre tiene to ser eliminado completamente para evitar falsos resultados positivos de matanza; péptido libre residual se ha demostrado que induce la apoptosis en cultivos de células T específicas de antígeno-9. Para descartar un efecto de péptidos solubles, correr las muestras de control de sobrenadante de péptido cargado y lavado KaAPC (ver 3.8). </li><li> Cuente perlas usando un hemocitómetro y la etiqueta con la fecha, nombre del péptido y la concentración. NOTA: Loaded KaAPC siendo funcional a 4 ° C durante al menos un mes. Después de un mes, volver a la carga con el mismo péptido permite KaAPC a utilizar durante un máximo de un año. </li></ol> 3. KaAPC Ensayo in vitro Killing <ol><li> Preparar los medios de co-cultivo. Preparar medio completo RPMI suplementado con 3% de factor de crecimiento de células T (hecho en el laboratorio 6) y el 3% de los donantes de plasma autólogo. Si los donantes de plasma autólogo no está disponible, utilizar suero AB humano inactivado por calor. </li><li> Preparar preparación tampón de unión AnnexinV. Disolver 8,12 g de cloruro de sodio (NaCl) y 0,12 g calccloruro de io (CaCl 2) en 990 ml ddH 2 O.Add 10 ml de tampón HEPES 1M. </li><li> Generar células T específicas de antígeno humanos. (Para un protocolo detallado por favor vea una publicación previa 7 utilizando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC)). Asegúrese de que la especificidad del péptido es al menos&gt; 75%, determinada por tinción de tetrámero. </li><li> Para cada muestra se incuba 2 x 10 5 células T específicas de antígeno / pocillo (en una placa de fondo redondo de 96 pocillos) en 200 l de medio de co-cultivo a una proporción de 1: 1 con KaAPC durante 48 horas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Muestras de la cosecha y transferir a un tubo FACS; lavar con 1 ml de tampón de unión AnnexinV, centrifugar a 300 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender en 100 l de tampón de unión AnnexinV </li><li> Muestras de la mancha con 1 l AnnexinV FITC y 5 l 7-AAD durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, se lavan con tampón de unión AnnexinV 1 ml; centrifugar a 300 xg durante 5 min, descartar un sobrenadanted resuspender en tampón de unión 250 l AnnexinV </li><li> Leer muestras inmediatamente en citómetro de flujo. </li><li> Preparar las siguientes muestras para determinar la matanza-antígeno específico por KaAPC: sólo las células T; Células T anti-CD95 + soluble; Células T + descargadas KaAPC; Células T + péptido no cognado cargado KaAPC; Células T + péptido cognado cargado KaAPC; T células + sobrenadante del péptido cognado cargado KaAPC. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figura 2. KaAPC ensayo de matar péptido cargado KaAPC o microesferas de control (HLA-A2-Ig sólo perlas) se cultivaron durante 48 horas a una relación 1: 1 con las células T específicas CMVpp65 (~ 80%), cosechada y posteriormente se tiñó con AnnexinV y yoduro de propidio (PI) para determinar la apoptosis mediante citometría de flujo (véase la sección de protocolo 3.3 a 3.7). &quot;afín&quot; se refiere a perlas cargadas con CMVpp65 y &quot;no afines&quot; a seranuncios cargados de Mart-1 péptido. Los números indican el porcentaje de células T viables en el cuadrante inferior izquierdo de cada parcela. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="9"><li> Para realizar entrecruzadas-experimentos, generar células T específicas de antígeno de dos especificidades diferentes. </li><li> Evaluación adicional de los depleción de habilidades específicas de antígeno de KaAPC con un análisis simultáneo de la eliminación específica de antígeno de células T en la población de células T heterogénea. (Para un protocolo detallado por favor vea Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS y MF tienen nada que revelar. En virtud de un acuerdo de licencia entre NexImmune y la Universidad Johns Hopkins, los Dres. Schneck y Oelke tienen derecho a acciones de imagen recibidos por la Universidad en las ventas de productos AAPC descritos en este artículo. También son dueños de NexImmune de stock, lo que está sujeto a ciertas restricciones en virtud de la política de la Universidad. Dr. Schneck es miembro de la compañía &quot;s Consejo de Administración y del Consejo Asesor Científico. Los términos de este acuerdo están siendo gestionados por la Universidad Johns Hopkins, de conformidad con su conflicto de intereses políticas.

El paso más crítico en el protocolo es asegurar la adecuada relación de señal 1 (péptido MHC) y la señal 2 (anti-Fas mAb). Hemos realizado experimentos de titulación intensivos para definir la proporción perfecta para la señal 1 y 2; se hizo evidente que las variaciones mínimas debido a las diferencias en el dímero HLA-A2 Ig o concentraciones anti-Fas mAb pueden interferir con el funcionamiento de la KaAPC. Por lo tanto, la concentración de ambas señales siempre debe ser verificada y la calidad de ambas proteínas se debe probar con frecuencia, incluso si se ordenó de una fuente comercial. Además, las concentraciones siempre deben ser determinados por el mismo ensayo como diferentes ensayos de detección pueden resultar en diferentes concentraciones. Funcionalidad del HLA-A2-Ig también puede verse afectada debido a replegamiento incompleta y / o la carga peptídica ineficiente. Además moléculas dímero pueden agregarse a los diferentes grados, lo que podría repercutir en la actividad funcional de la proteína. Por lo tanto, la actual cantidad de dímero necesario para la generación de un KaAPC funcional y específica puede variar. Además, se encontró que el rango ideal para la inducción de la muerte de la señal anti-Fas mAb en KaAPC es extremadamente apretado. En nuestras manos cantidades mayores 3,64 g / ml conducen a la muerte no específica de células T positivas Fas mientras que las cantidades por debajo de 3,64 g / ml resultaron en una reducción de la actividad de matar dependiendo de la dosis. Si bien estas condiciones parecen bastante estrecho, atención a estos detalles resultará en la generación de un KaAPC funcional y específico. Mientras que la corriente fenotipo KaAPC es funcional para el agotamiento de células T activadas específicas de antígeno, los experimentos iniciales dirigidas a células T específicas de antígeno ingenuo o descansando demostrado ninguna inducción significativa de apoptosis específica de antígeno ya que estas poblaciones han reducido la expresión de Fas. Por lo tanto, se podría prever la adición de una señal co-estimuladora sobre el KaAPC para inducir la regulación al alza de Fas en células T en reposo para que se conviertanen un objetivo para el KaAPC. Mientras que esto es factible las tres señales tendrán que ser valorada cuidadosamente para asegurar un fenotipo KaAPC funcional. Ajuste de la plataforma del talón a una matriz biocompatible o biodegradable mejorará KaAPC aplicabilidad en vivo. Recientemente, Shen et al. Han informado de la exitosa en el uso in vivo de KaAPC la utilización de 5 micras perlas de látex conjugadas con anti-Fas (Jo2 clon) y anti-His / H2-K b -TRP2 11. Hemos sido capaces de demostrar que el concepto general de las células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) se puede transferir con éxito de micras de tamaño de partículas de tamaño nm 12 y que la funcionalidad está influenciada por la geometría de las partículas 13. Por lo tanto, variando el tamaño y / o forma de la futura KaAPC diseña uno podría ser capaz de afectar a la funcionalidad in vivo y bio-distribución, lo que podría ser la clave para el éxito del tratamiento de enfermedades autoinmunes específicas de órganos. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC superar las principales deficiencias de las estrategias de reducción de células basado en un fácil utilizar el &quot;off the shelf&quot;, el tiempo y el enfoque de costo eficiente que es independiente de la condición de los donantes y de pre-tratamiento. KaAPC no son blancos de auto o la señalización paracrina asesinato y no es sensible a las funciones efectoras citolítica de CTL. KaAPC exigirá la identificación del antígeno de la enfermedad relevante y confiar en su tipo HLA específico. Mientras que en la actualidad numerosos antígenos HLA-A2 restringidas adecuados para la diabetes tipo 1, la EICH y la esclerosis múltiplos se han identificado 2, el desarrollo de HLA de clase I adicional dímero moléculas, así como la identificación continua de nuevos antígenos relevantes autoinmunes aumentará aún más y ampliar la aplicabilidad de KaAPC. Además se podría pensar en utilizar KaAPC dirigido a diferentes epítopos para apuntar múltiples antígenos simultáneamente. En resumen, KaAPC representan una tecnología de plataforma flexible para un-Tigen depleción de células T específica. Su naturaleza &quot;-lego como&quot; permite la inclusión de nuevas señales como señales co-estimuladoras o inhibidoras adicionales como PD1 o mapa en diversas matrices, lo que podría ampliar y mejorar su posterior in vitro e in vivo aplicabilidad. Nosotros en este documento presentamos el protocolo paso a paso para generar KaAPC, el enfoque basado en primer talón para la eliminación de las células T específicas de antígeno a partir de mezclas de células T con diferentes especificidades. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. KaAPC eliminar CTL de una manera específica de antígeno marcado con PKH26 activado Fas + CTL efectoras de memoria y PKH67-etiquetado CMVpp65 CTL específicos del mismo donante se mezclaron a una 1:. Relación de 1 y co-cultivadas con CMVpp65 KaAPC durante 48 h. Los cultivos de control fueron tratados con KaAPC descargado, o 1 mg / mlde soluble anti-Fas-mAb (clon CH11). Pérdida mínima de células viables se determinó en cultivos mixtos de CTL no tratados (T) de la mezcla. Se muestran los datos de FACS originales para cada población de CTL de la mezcla de T. Se realizó un análisis de la apoptosis como se publicó anteriormente por gating separado en ambas poblaciones de células T 10. Números representados en los cuadrantes superiores izquierda representa% de las células totales. La figura ilustra se deriva de un experimento representativo de tres experimentos independientes. Esta investigación fue publicada originalmente en la sangre. . Schütz, C. et al asesino de las células presentadoras de antígeno artificiales: una nueva estrategia para eliminar las células T específicas de Sangre.. 2008; 111, 3546-52. Derecho de Autor de la Sociedad Americana de Hematología. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Durante las dos últimas décadas se ha avanzado mucho en la comprensión de los mecanismos patogénicos de las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, los tratamientos más comunes todavía dependen de los corticosteroides y los fármacos inmunosupresores tales como análogos de la purina, agentes alquilantes y los inhibidores de la calcineurina 1. El uso de estos fármacos ha mejorado en gran medida el pronóstico de los pacientes, sin embargo, el tratamiento no proporcionar una cura de la anomalía inmunológica subyacente. Además, los pacientes se vuelven vulnerables a las infecciones y para el desarrollo del cáncer. Por lo tanto el objetivo final para el tratamiento de enfermedades mediadas por células T autoinmunes y rechazo de aloinjerto es apuntar específicamente sólo la enfermedad causando que las células T mientras que, al mismo tiempo, dejando el sistema inmune restante intacto y competente para combatir los trastornos inmunológicos. Utilizando células presentadoras de antígeno (APC) como tratamiento para suprimir las respuestas de células T periféricas que se describió primero tan pronto comola década de 1970 por varios grupos. Desde entonces se han desarrollado muchos enfoques basados ​​en células (revisado en Schütz et al. 2). Las estrategias que utilizan FasL expresan asesino-APC como células inmunorreguladoras mostraron resultados prometedores que indican un potencial terapéutico para el tratamiento de la autoinmunidad, rechazo de aloinjertos y las infecciones crónicas. Sin embargo, existen limitaciones significativas con las estrategias que utilizan FasL Killer-APC que en última instancia han limitado su aplicabilidad clínica; (I) la generación o el aislamiento de APC es el tiempo, la mano de obra y el coste intensivo (ii) pacientes que sufren de la citopenia debido a la inmunosupresión proporcionan cantidades y calidad de las células limitadas (iii) revestimiento o la transducción de señales de APC con inductores de apoptosis tales como resultados de FasL en altamente fenotipos variables y (iv) Killer-APC son sensibles a citotóxicos funciones efectoras de las células T en consecuencia la reducción de su potencial terapéutico. Por lo tanto, es difícil garantizar un reproducible fenotipo Killer-APC definidotipo que puede ser utilizado para la modulación específica de antígeno de las respuestas de células T in vivo. Sobre la base de nuestro trabajo previo con FasL expresión Killer-APC 3-5 y células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) 6,7 desarrollamos un enfoque basado en el talón (KaAPC) para la inhibición específica de antígeno o la eliminación de las células T autorreactivas en vitro. KaAPC consiste de un dímero de HLA-A2-Ig (señal 1) y un mAb anti-Fas (apoptosis induciendo señal) covalentemente inmovilizado sobre una superficie de una perla de látex paramagnético 4,5 m. Ellos agotar las células T específicas de antígeno de una manera mediada por Fas / FasL a partir de cultivos de células T de múltiples especificidades de una manera específica de antígeno e independiente de la muerte celular inducida por activación (AICD) y la vía. Dosis dependiente de la apoptosis en las células T específicas se induce rápidamente ya después de 30 min 8. KaAPC se puede generar fácilmente de una manera controlada asegurando un definido fuera de la plataforma phenotype y superar la mayoría de las deficiencias de las estrategias de reducción de células basado. En consecuencia, KaAPC mostrar un gran potencial para el tratamiento de enfermedades mediadas por células T autoinmunes y rechazo de aloinjertos, avanzar en el campo de las estrategias de tratamiento específicas de células T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

El tratamiento actual de las células T mediadas enfermedades autoinmunes se basa principalmente en las estrategias de inmunosupresión global, lo que, a largo plazo, se acompaña de efectos secundarios adversos tales como una disminución de la capacidad para controlar las infecciones o tumores malignos. Por lo tanto, los nuevos enfoques deben ser desarrollados que se dirigen a las células sólo la enfermedad mediación y dejar el sistema inmunológico queda intacta. Durante la última década una serie de estrategias de inmunoterapia basada en células para modular de células T mediada por la respuesta inmune han sido desarrollados. La mayoría de estos enfoques se basan en células presentadoras de antígeno que induce tolerancia (APC). Sin embargo, además de ser técnicamente difícil y engorroso, tales enfoques basados ​​en células son muy sensibles a las respuestas de células T citotóxicas, lo que limita su capacidad terapéutica. Aquí se presenta un protocolo para la generación de células presentadoras de antígeno artificiales asesinas no celular (KaAPC), que permite el agotamiento de células T patológicos, dejando la resistema inmune restante intacto y funcional. KaAPC es una solución alternativa a la inmunoterapia celular que tiene potencial para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y rechazos de aloinjertos mediante la regulación de las respuestas indeseables de células T de una manera específica de antígeno.

Las características de este protocolo incluyen la generación de un fenotipo definido KaAPC que muestra HLA-A2-Ig (señal 1) y anti-Fas mAb (señal de apoptosis) al mismo tiempo, que en comparación con los enfoques basados ​​en células no está alterado por recubrimiento o eficacias de transducción y pueden modularse fácilmente durante la producción (Figura 1). Además, KaAPC, no son sensibles a las funciones efectoras citotóxicas de las células T y su funcionalidad no es dependiente de la calidad de las células presentadoras de antígeno autólogas pre y post manipulación in vitro. KaAPC son capaces de agotar las células T específicas de antígeno in vitro cuando se carga con el péptido cognado, mientras que no afines cargado KaAPC no agotar las células T (Figura 2). Por lo tanto, KaAPC inducir apoptosis de las células T de una manera específica de antígeno. Posteriormente, se utilizó KaAPC para el agotamiento selectivo de células T específicas de antígeno a partir de una mezcla de diferentes SPE células Tcificities, lo que demuestra que sólo un mínimo de citotoxicidad se filtra en las células T de vecinos (Figura 3). Por lo tanto, representan una herramienta KaAPC exquisita para el agotamiento in vitro específica de antígeno de las células T específicas de antígeno humanos activados con un potencial aplicabilidad clínica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y rechazos de aloinjertos.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Directrices se presentan para la generación de antígeno artificial asesino células presentadoras, KaAPC, una herramienta eficaz para el agotamiento in vitro de células T específicas de antígeno humanos y una solución alternativa a la inmunoterapia celular para el tratamiento de la T enfermedades autoinmunes mediadas por células en un antígeno forma específica sin comprometer el sistema inmune restante.

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K vistas.  Johns Hopkins University.  Directrices se presentan para la generación de antígeno artificial asesino células presentadoras, KaAPC, una herramienta eficaz para el agotamiento in vitro de células T específicas de antígeno humanos y una solución alternativa a la inmunoterapia celular para el tratamiento de la T enfermedades autoinmunes mediadas por células en un antígeno forma específica sin comprometer el sistema inmune restante. 

Video: Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antígeno Específico de la En Vivo Matar ensayo utilizando CFSE células diana marcadas

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Investigación

Inmunología e Infección

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Cuantificación de células CD4+ T específicas de antígenos humanos que utilizan éster de succinidilo de carboxifluoresceína

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...