Inyecte de uno a tres miligramos de anticuerpo anti-ratón CD45 conjugado con fluoróforos diluido en 100 mililitros de solución salina normal por vía intravenosa en cada ratón anestesiado. Comience colocando cuatro mililitros de tampón HEPES helado preparado en un tubo disociador de tejido especializado en hielo para cada ratón. Después de sacrificar al ratón, coloque los pulmones resecados en su respectivo tubo disociador de tejidos, enfriado en hielo.
Coloque los tubos en el disociador de tejido automatizado y ejecute el primer programa preestablecido para el tejido pulmonar. A continuación, añada 500 microlitros de solución madre de liberasa y 500 microlitros de solución madre de aminoguanidina a cada tubo que contenga el tejido pulmonar disociado. Incubarlo en una batidora nutadora durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, vuelva a colocar los tubos en el disociador y ejecute el segundo programa preestablecido para el tejido pulmonar. Ahora vierta la suspensión unicelular del tubo disociador de tejidos a través de un filtro celular de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el tubo disociador de tejidos con cinco mililitros de EHAA completo y páselo a través del filtro al tubo de 50 mililitros.
Después de quitar el colador, aumente el volumen de la suspensión celular a 50 mililitros con EHAA completo. En lugar de usar tubos disociadores de tejidos especializados, coloque los pulmones resecados en sus respectivos tubos de microfuga de 1,5 mililitros enfriados en hielo. Una vez que se hayan extraído todos los pulmones, transfiera cada pulmón a un tubo de microfuga nuevo sin ningún medio celular.
Con unas tijeras, corte los pulmones en pequeños fragmentos dentro del tubo de microfuga. Agregue un mililitro de cóctel de digestión liberase TM y DNase I a cada tubo. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un baño de agua.
Luego, vierta la muestra sobre un filtro de células de 100 micrómetros colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros. Pipetee la muestra restante en el colador. Machaca el pañuelo contra la malla con el extremo de goma del émbolo de una jeringa estéril de un mililitro.
Enjuague el colador con tampón clasificador en frío, recogiendo un volumen final de siete mililitros en el tubo. Ya sea utilizando el método de disociación automatizado o manual, centrifugar la suspensión celular obtenida. Aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 100 microlitros de sobrenadante y la célula granulada.
Finalmente, agregue aproximadamente 100 microlitros de solución de bloque Fc para llevar el volumen total hasta 200 microlitros y haga un vórtice vigoroso para resuspender el pellet.
