Enriquecimiento de la muestra pulmonar para células T mediante enriquecimiento de perlas magnéticas

Para empezar, añada 50 microlitros de microperlas anti-ratón CD90.2 a las células pulmonares aisladas. Después de vorexionar la mezcla, incubarla durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, coloque una columna de separación de células paramagnéticas en un imán de separación de células de una o cuatro posiciones.

Coloque un tubo cónico abierto de 15 mililitros debajo de cada columna para capturar el flujo a través de él. Prepare la columna con tres mililitros de tampón clasificador en frío, lo que permite que la columna drene por gravedad en el tubo cónico que se encuentra debajo. Después de que las células se hayan incubado con las microperlas durante 10 minutos, agregue tampón clasificador en frío a un volumen de un mililitro y transfiera la mezcla a través de un colador de células de 100 micrómetros colocado encima de la columna.

Recoja el flujo de la columna a través de un tubo cónico nuevo de 15 mililitros colocado debajo de la columna. Una vez que la suspensión de la celda se haya drenado completamente a través de la columna, agregue tres mililitros adicionales de tampón clasificador en frío al tubo original y aplíquelo a la columna a través de la malla antes de quitar el colador. Cuando la muestra se haya drenado completamente en la columna y no salga más flujo, retire la columna del imán y colóquela encima de un tubo cónico nuevo de 15 mililitros.

Agregue cinco mililitros de búfer de clasificador en frío a la columna. Para eluir las celdas unidas, empuje el émbolo de la columna hacia abajo con un movimiento continuo, forzando el tampón fuera de la parte inferior hacia un nuevo tubo. Centrifugar las muestras eluidas a 400 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 microlitros del sobrenadante y la pastilla celular. En promedio, el proceso de enriquecimiento recupera más del 99% de todas las células T CD90.2 positivas de los pulmones con una pureza superior al 90%.