Para comenzar, coloque un ojo de ratón formal y fijo en un trozo de papel encerado bajo un microscopio de disección. Con un par de micropinzas, sujete los restos del músculo y el nervio óptico. A continuación, oriente el ojo de modo que la córnea mire hacia un lado.
Ahora use una cuchilla quirúrgica para hacer una incisión de uno a dos milímetros de largo detrás y paralela al limbo. Aplique una fuerza hacia abajo con la cuchilla mientras mantiene el ojo en su lugar hasta que el segmento anterior se separe del extremo posterior. A continuación, deseche el segmento anterior y el cristalino.
Transfiera el segmento posterior a un plato de seis centímetros lleno de PBS. Use una espátula microscópica para extraer la retina mientras sostiene simultáneamente el nervio óptico con micropinzas. Para enjuagar la retina, transfiérala a un pocillo de una placa de 12 pocillos que tiene seis pocillos llenos de agua destilada doble.
Utilice una pipeta P1000 para pipetear cuidadosamente el agua hacia arriba y hacia abajo adyacente a la retina mientras sopla el agua para provocar una agitación suave. A continuación, utilice una pipeta de vidrio invertido para transferir la retina al segundo pocillo. Para digerir la retina, transfiera la retina enjuagada a una solución de tripsina en una placa de 12 pocillos con una pipeta de vidrio invertido.
Centre una punta de pipeta P200 empapada en tripsina en el nervio óptico. A continuación, pipetear suavemente toda la red vascular hacia arriba y hacia abajo para disociar el tejido no vascular. Ahora, use una pipeta de vidrio invertido previamente enjuagada con tripsina para transferir la vasculatura de la retina a un pocillo que contenga agua destilada doble en una placa de seis pocillos.
Gire la placa, luego pipetee la vasculatura hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio enjuagada con tripsina invertida para eliminar cualquier tejido no vascular residual. Transfiera cuidadosamente la vasculatura de la retina al centro de la región marcada en un portaobjetos de microscopía de superficie cargada. A continuación, utilice una pipeta P200 para eliminar con cuidado el exceso de agua de uno de los bordes.
Coloque el portaobjetos en una cabina de bioseguridad cerca de la parte frontal para permitir que el agua residual se evapore. Cuando la vasculatura esté casi seca, transfiérala bajo un microscopio de contraste de fase. Utilice una pipeta P200 para añadir lentamente agua bidestilada en un lado de la región marcada para rehidratar cuidadosamente la vasculatura.
La fijación de la vasculatura retiniana aislada dio como resultado un tejido estructuralmente robusto y suficientemente duradero adecuado para las mediciones de AFM. Por el contrario, los vasos retinianos aislados de los ojos no fijos o brevemente fijos se fragmentaron y colapsaron.
