Para comenzar, coloque el medio de imagen precalentado y las placas de microscopía estériles con superficies de vidrio revestidas o no recubiertas en una plataforma de trabajo. Después de eliminar el medio que rodea el molde de agarosa, vuelva a suspender cuidadosamente el contenido de los moldes en un medio de 190 microlitros antes de transferir los esferoides flotantes a un vial de dos mililitros. En el caso de los esferoides en una placa de baja fijación, transfiera los esferoides uno por uno de los pocillos individuales a un vial.
Deje que los esferoides se asienten en el fondo del vial durante cinco minutos, formando una bolita visible. Retire el medio del vial, dejando los esferoides intactos, y vuelva a suspenderlos suavemente en una cantidad suficiente de medio McCoy's 5A fresco. Ahora, transfiera un volumen igual de suspensión de esferoide por pocillo de la placa de microscopía.
Incubar el esferoide durante 1 a 2 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Agregue una sonda de fluorescencia a un volumen conocido de suspensión de esferoide y continúe la incubación durante 1 hora a 37 grados Celsius. Después de la incubación, cambie los medios que contienen sondas fluorescentes con un volumen necesario de medios de imagen.
Inicie el software de control del microscopio e inicialice la calibración de la platina. A continuación, elija el objetivo requerido. Elija la ventana Abrir proyecto y haga clic en Crear un nuevo proyecto.
A continuación, haz clic con el botón derecho del ratón en el proyecto recién creado y selecciona la opción Cambiar nombre en el menú desplegable. Asigne un nombre estándar al archivo del proyecto de investigación. Abra la ventana Adquisición.
Establezca el pulso, la luz blanca, la excitación del láser, la longitud de onda y el rango requerido de detectores de escaneo híbridos o de resonancia. A continuación, elija los tipos de escaneo de línea o marco. En la ventana Adquisición, seleccione el modo FLIM para realizar imágenes combinadas con el recuento de fotones.
Luego, elija la tasa de repetición de pulso láser de luz blanca. Inicie la vista previa de la imagen con el modo Fast Live y ajuste el enfoque fino del objeto de imagen en una sección de interés. Al observar el histograma de intensidad de píxeles, ajuste el tamaño y la resolución adecuados del agujero de alfiler de la intensidad del láser.
Mientras está en Fast Live, establezca las coordenadas y la dirección de escaneo y atribuya que comiencen y terminen en la ventana Z-Stack. Elija un tamaño de paso z o un número de pasos. Una vez que se hayan aplicado todos los ajustes necesarios, comience a tomar imágenes.
Asigne a la imagen un nombre adecuado y guarde el proyecto de imagen. Los diferentes métodos de formación dieron lugar a diferentes tamaños de esferoides. Los esferoides HCT116 en placas de fijación baja fueron significativamente más grandes después de cinco días en comparación con los métodos de alto rendimiento.
Los métodos de baja adherencia condujeron al desarrollo evidente de un núcleo necrótico detectado por la tinción de yoduro de propidio. Por el contrario, los esferoides generados con otros métodos demostraron la distribución difusa de las células muertas en todo el cuerpo esferoide. La oxigenación en esferoides HCT116 producidos por diferentes métodos mostró más esferoide oxigenado con el microtejido y los micromoldes hechos en laboratorio que la placa esférica 5D.
La oxigenación esferoide de los esferoides Sphericalplate 5D mostró una menor oxigenación en comparación con el microtejido y los micromoldes hechos en laboratorio. El análisis de fasores de esferoides HCT116 realizado con placas de baja fijación revela la presencia de núcleos glucolíticos y no glucolíticos a través de NADPH-FLIM de dos fotones.
