Desarrollo de células CAR-T sensibles a la hipoxia mediante transducción lentiviral

Para comenzar, coloque un vial de células mononucleares de sangre periférica humana criopreservadas en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez descongelado, transfiera la suspensión de PBMC a un tubo de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de TGM. Centrifugar el tubo a 300 g durante cinco minutos después de pipetear una alícuota de la suspensión celular para contar.

Vuelva a suspender el PBMC peletizado en tres mililitros de TGM. Luego, transfiera el volumen requerido de suspensión celular a una placa de seis pocillos. El día antes de la reanimación celular, transfiera 100 microlitros de perlas magnéticas de inmunoglobulina G de ratón a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Agregue un mililitro de PBS a los tubos y colóquelos en un soporte magnético para lavar las cuentas. Vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de PBS. A continuación, añada los anticuerpos a la suspensión.

Utilice una pipeta para mezclar suavemente la suspensión. Coloque la suspensión en un balancín a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de lavar las cuentas en PBS como se hizo anteriormente, vuelva a suspenderlas en 100 microlitros de PBS.

Ahora agregue las perlas inmunológicas recubiertas de NHCD3 hCD28 a la placa e incube. Después de 48 horas de incubación, mezcle y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Coloque el tubo en un soporte magnético durante tres minutos.

Luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros. Siembre cinco veces 10 a la potencia de cinco PBMC en 300 microlitros de TGM en los pocillos de una placa plana de 48 pocillos. Pipetear 200 microlitros de caldo lentiviral en los pocillos correspondientes.

A continuación, añada sulfato de protamina hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro antes de centrifugar. Pipetear 300 microlitros del sobrenadante de cada pocillo, luego agregue un mililitro de TGM fresco en cada pocillo. Coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono.

Agregue 0,5 a dos mililitros de TGM fresco al plato cada dos o tres días. A continuación, transfiera las células a una placa de 12 pocillos, seguida de una placa de seis pocillos hasta que la densidad total de células alcance los 6 millones en un volumen de cuatro mililitros.