Nuestro laboratorio diseña receptores inmunitarios artificiales, como los receptores de antígenos quiméricos, y estudia cómo afectan a la biología reguladora de las células T. Mediante la invención de nuevas secuencias de ADN y el uso de modelos de enfermedad humanizados en ratones, nuestro objetivo es crear terapias de células inmunitarias diseñadas para enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplantes, cáncer y envejecimiento. Al diseñar receptores de antígenos quiméricos para células T reguladoras, es crucial tener en cuenta su fuerza.
Las Tregs CAR de alta afinidad se comportan más como células T efectoras, produciendo un aumento de las citocinas inflamatorias y demostrando una mayor actividad letal. Nuestra investigación en curso indica que la reducción de la afinidad por CAR conduce a mejores perfiles de citocinas y función en CAR Tregs. El campo CAR Treg es incipiente y carece de estandarización.
Nuestro protocolo presenta un enfoque robusto y universal para generar y probar CAR Tregs. Esto mejora la reproducibilidad y acelera la innovación, al tiempo que guía a los laboratorios nuevos en la investigación de CAR Treg, especialmente dados los desafíos de la escasez de Treg y los requisitos especializados. Estudiamos los mecanismos que utilizan las células T reguladoras para mantener el equilibrio inmunitario y promover la cicatrización de los tejidos.
Nuestra investigación incluye la comprensión de la señalización y la función de CAR Treg, así como la exploración de nuevos contextos de enfermedades en los que la terapia con CAR Treg puede ofrecer beneficios únicos en comparación con las estrategias actuales. Para comenzar, transfiera el contenido del leukopak a un tubo cónico de 50 mililitros. Añadir un volumen igual de DPBS con un 2% de suero bovino fetal y mezclar suavemente con una pipeta.
Girar el tubo a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez aspirado el sobrenadante, se reconstituye el pellet celular en dos mililitros de DPBS con 2% de suero fetal bovino. A continuación, añada ocho mililitros de solución de cloruro de amonio a la suspensión celular y mezcle mediante una inversión suave.
Una vez retirado el descanso, centrifugar las células lavadas a 150 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en 30 mililitros de DPBS con suero bovino fetal al 2%. Luego, baje 10 a la potencia de ocho a 10 a la potencia de nueve PBMC a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Y vuelva a suspender en el tampón de separación celular a una concentración de cinco veces 10 a la potencia de siete células por mililitro. Para la clasificación celular asistida por fluorescencia de las células T reguladoras, centrifuga las células CD4 positivas a 500 g durante cinco minutos. Luego, reconstituya las células en 200 microlitros de DPBS.
Por cada millón de células, agregue un microlitro de FITC CD4 antihumano, un microlitro de APC CD25 antihumano y un microlitro de PE CD127 antihumano. Después de vorexizar suavemente el tubo, colóquelo en un refrigerador a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Una vez que las células se lavan con 10 mililitros de DPBS con 2% de suero bovino fetal, gírelas a 500 g durante cinco minutos y vuelva a suspender suavemente las células teñidas a 1,5 veces 10 a la potencia de siete células por mililitro en DPBS con 2% de suero bovino fetal. A continuación, pase la suspensión celular teñida a través de una tapa de filtro de 40 micrómetros en tubos de clasificación celular asistidos por fluorescencia.
Prepare tubos de recolección de 15 mililitros que contengan tres mililitros de medio RPMI10 y colóquelos en hielo. Por último, clasifique los linfocitos T reguladores CD4 positivos, CD25 altos, CD127 negativos y los linfocitos T convencionales CD4 positivos, CD25 bajos y CD127 positivos mediante la clasificación de células asistida por fluorescencia. Para empezar, tome las células T reguladoras aisladas de la sangre humana 48 horas después de la activación y vuelva a suspenderlas.
Después de contar las celdas, gire a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Resuspender las células T reguladoras en RPMI10 a 1,25 veces 10 a una potencia de seis células por mililitro con 1.000 unidades internacionales por mililitro de interleucina-2. Ahora, agregue cada alícuota de lentivirus a 2,5 por 10 a la potencia de cinco células T reguladoras en 200 microlitros en un tubo de microcentrífuga.
Espinoculado a 1.000 g durante una hora a 32 grados centígrados. Mueva cada reacción de 200 microlitros a una placa de 24 pocillos. Incubar la placa con las células T reguladoras transducidas en una incubadora de cultivo de tejidos durante la noche.
Rellene cada pocillo a dos mililitros con medio RPMI10 con una concentración final de interleucina-2 de 1.000 unidades internacionales por mililitro. Evalúe la eficiencia de la modificación génica mediante citometría de flujo, como se muestra aquí. Para comenzar, tome células T reguladoras resuspendidas con perlas anti-CD3, CD28 en un tubo cónico de 15 mililitros 48 horas después de la activación.
Incubar la suspensión celular en un imán durante tres minutos. Mientras está en el imán, transfiera las células del medio a través de una pipeta a un tubo nuevo. Después de retirar las perlas, deje que las células T reguladoras desperladas descansen en RPMI10 durante dos horas.
A continuación, centrifuga las células T reguladoras a 500 g durante cinco minutos. Una vez decantado el sobrenadante, se resuspenden las células en un medio sérico reducido precalentado a cuatro veces 10 a una potencia de seis células por mililitro. Células alícuotas en 100 microlitros en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros de unión a proteínas bajas.
Agregue el virus adenoasociado al receptor de antígeno quimérico en una multiplicidad de infección de 20.000 a cada muestra y vuelva a suspender. A continuación, incube los tubos de reacción en la incubadora de cultivo de tejidos durante una hora. Durante la incubación, prepare complejos de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 añadiendo 8,3 microlitros de proteína Cas9 a 2,5 microlitros de ARN guía simple, dirigiéndose al locus del gen de seguimiento.
Después de mezclar bien los componentes, incubar la mezcla de ribonucleoproteínas durante 15 minutos a 37 grados centígrados en la incubadora de cultivo de tejidos. A continuación, llene un tubo de electroporación nuevo con tres mililitros de tampón de electroporación de alta osmolaridad. Inserte el tubo de electroporación lleno en la estación de pipetas del sistema de electroporación hasta que se escuche un clic.
Establezca las condiciones de electroporación en 2, 200 voltios, 20 milisegundos, un pulso en el sistema de electroporación. Cuando se complete la incubación de una hora con el virus adenoasociado, haga girar las células con el virus a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez aspirado el sobrenadante, se resuspende el pellet celular en 100 microlitros del tampón de resuspensión celular proporcionado por el sistema de electroporación por muestra.
A continuación, añadir 10,8 microlitros de complejo de ribonucleoproteínas por muestra y mezclar bien con una pipeta sin crear burbujas. Ahora, inserte una punta de electroporación de 100 microlitros empujando la pipeta hasta su segundo tope para abrir la abrazadera. Coloque el cabezal superior de la pipeta en la punta de electroporación hasta que la abrazadera encaje de forma segura con el vástago de montaje del pistón.
Suelte gradualmente el botón mientras mantiene la presión hacia abajo sobre la pipeta para asegurarse de que la punta encaje perfectamente sin espacios. A continuación, presione la pipeta hasta el primer tope y sumerja la punta de electroporación en la mezcla de ribonucleoproteínas de la célula. Tire suavemente de la muestra hacia arriba en la pipeta sin que queden burbujas.
Inserte la pipeta con la punta de electroporación montada que contiene la muestra verticalmente en el tubo E hasta que se escuche un clic. Después de confirmar la configuración óptima para las células T reguladoras humanas, presione Inicio en la pantalla táctil para electroporar las células. Espere a que la pantalla táctil se muestre completa.
Retire suavemente la pipeta e inmediatamente transfiera la muestra a la placa de seis pocillos preparada que contiene 2,5 mililitros de medio RPMI10 precalentado sin antibióticos con interleucina-2 por pocillo. Después de mecer suavemente la placa con movimientos lineales, colóquela en la incubadora de cultivo de tejidos. Al día siguiente, de 16 a 18 horas después, reemplace el medio por un medio que contenga antibióticos.
Cuente las células T reguladoras electroporadas y el cultivo a 10 hasta la potencia de seis células por mililitro con 1.000 unidades internacionales por mililitro de interleucina-2.
