Para comenzar, coloque las células T transducidas por CAR cultivadas en dos placas de 12 pocillos que contienen dos mililitros de TGM. Coloque una placa directamente en una incubadora humidificada bajo un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Coloque la otra placa en una cámara de incubadora móvil de dióxido de carbono, oxígeno y nitrógeno con el nivel de oxígeno preestablecido en 1%Recoja 500, 000 células de las placas cada 24 horas en ambas condiciones en tubos de microcentrífuga de 1.5 mililitros.
Centrifugar los tubos a 500 g durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante, pipetee suavemente un mililitro de PBS en el pellet de la celda. Resuspender las células peletizadas en 50 microlitros de tampón FACS.
A continuación, añadir 50 microlitros de una dilución de uno a 100 de anticuerpo anti-bandera conjugado con ficoeritrina. Pipetea la suspensión para mezclar bien. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón FACS a cada tubo.
Centrifugar la suspensión mixta a 500 g durante cinco minutos. Ahora, pipetea los sobrenadantes de cada tubo. A continuación, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón FACS.
Transfiera la suspensión celular resultante a tubos de citometría de flujo de cinco mililitros. Realice citometría de flujo en la suspensión celular para determinar la expresión del receptor de antígeno quimérico de superficie. Configure los tubos nuevos como en blanco y CAR.
Haga clic en el canal FSCA, FSCH, SSCA, SSCH, PE y FITC. A continuación, cree cuatro diagramas de dispersión para identificar secuencialmente células individuales, células vivas, células GFP positivas y células PE positivas. Establezca los parámetros para recolectar 10.000 células vivas individuales.
Haga clic en adquirir datos. Una vez que la recopilación de celdas sea estable, haga clic en registrar datos. Para determinar la ubicación de las puertas de acuerdo con el control negativo, se deben aplicar las células positivas para EGFP y ficoeritrina para medir la positividad de ficoeritrina y la intensidad media de fluorescencia.
El sensible a la hipoxia por dos CAR dirigido a CAR mostró expresiones significativamente altas de CAR en condiciones hipóxicas en relación con las condiciones normóxicas.
