Para comenzar, siembre 1000 células objetivo en cada pocillo de dos placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano que contienen 200 microlitros de FBSDMEM. Al día siguiente, pipetee cuidadosamente 100 microlitros del sobrenadante de la parte superior de cada pocillo. Agregue linfocitos T con receptor de antígeno quimérico o linfocitos T no transducidos en 100 microlitros de FBSDMEM en diferentes proporciones.
Coloque una placa en una atmósfera de oxígeno al 21% y la otra en una cámara incubadora móvil de dióxido de carbono, oxígeno y nitrógeno bajo una atmósfera de oxígeno al 1%. Después de 24 horas de co-cultivo, use una pipeta para transferir cuidadosamente todo el sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U. Almacene el sobrenadante a menos 20 grados centígrados para la detección de citocinas.
Ahora agregue 60 microlitros de tampón de lisis pasiva en cada pocillo experimental de las placas negras de fondo plano de 96 pocillos. Coloque las placas en un agitador durante 30 minutos para garantizar una lisis celular eficiente. Agregue 60 microlitros de sustrato de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de fuego en cada pozo experimental.
Utilice un lector de microplacas para medir la actividad de la luciferasa inmediatamente. Finalmente, calcule el porcentaje de citotoxicidad normalizado con la ecuación dada. El CAR HER2 sensible a la hipoxia fue capaz de matar eficazmente las células diana, independientemente de si la atmósfera era hipóxica o normóxica.
Por el contrario, las células CAR-T HER2-BBz-ODD mostraron una citotoxicidad significativamente más débil en condiciones normóxicas para todas las condiciones.
