Para empezar, obtenga células leucémicas cultivadas en condiciones óptimas para el trasplante. Después de contar las células, explíquelas a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Para la tinción con CM-Dil, vuelva a suspender las células en la solución de trabajo para obtener una multiplicación de 10 elevado a la potencia de seis células en 100 microlitros e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Lave las células dos veces con 10 mililitros de 1X HBSS a temperatura ambiente. Después de peletizar las células a 300 g durante cinco minutos, vuelva a suspenderlas en PBS que contenga 1% de FBS para lograr una densidad de 40, 000 células por microlitro. A continuación, encienda el microinyector y la bomba.
Ajuste la presión de inyección a nueve a 11 libras por pulgada cuadrada, y el tiempo de inyección a 0.5 segundos para recortar la aguja y ajustar el orificio. Cargue alrededor de cinco microlitros de la línea de suspensión de células tumorales en la microaguja con cuidado, en una sola pasada, evitando la formación de burbujas de aire. Con las pinzas Dumont 5, corte el extremo de la aguja para producir un orificio que pueda soportar la expulsión.
A continuación, seleccione embriones sanos de pez cebra bajo el microscopio, eliminando los que presenten anomalías en el desarrollo. Con una pipeta Pasteur de vidrio, recoja los embriones anestesiados y coloque de 10 a 15 de ellos en posición lateral en la placa de agarosa al 1,5%. Eliminar el exceso de agua para dejar una cantidad mínima para la supervivencia del embrión.
A continuación, confirme bajo el microscopio óptico que la aguja está bien cortada y tiene células. Inyecte de 10 a 15 nanolitros correspondientes a 400 a 600 células en la yema de los embriones durante 0,2 a 0,3 segundos. Después de inyectar todos los embriones, recójalos en agua fresca para embriones.
Una hora después de la inyección, controle el bolo de células para separar los embriones con tinción óptima o bolo bueno de aquellos con tinción inferior o bolo inferior. La tinción con CM-Dil y el marcado de proteínas fluorescentes permitieron el seguimiento de la progresión de la enfermedad mediante microscopía. Y la supervivencia de los embriones disminuyó después de la inyección con dos líneas de leucemia genéticamente distintas.
