Agradecemos al Centro de Medicina Comparativa e Investigación de Dartmouth College por proporcionar la cría diaria de los animales utilizados en este protocolo. También agradecemos a Leah Jacob y Adwaita Bose por su ayuda para probar el protocolo y fotografiar a los animales. Por último, agradecemos al laboratorio de Ann Miller por su formación en la práctica del tatuaje. Este trabajo fue apoyado por la subvención R00 de los NIH GM147826 a J.L.

Todos los procedimientos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College.
1. Configuración del equipo
NOTA: Se incluye un flujo de trabajo para el procedimiento y un ejemplo de configuración del banco (Figura 1).
<ol><li>Conecte la pistola de tatuaje y el pedal a la fuente de alimentación. Coloque el pedal debajo de la superficie de trabajo.</li>
	<li>Montaje de la pistola de tatuajes<ol><li>Con una llave Allen o un destornillador hexagonal, afloje los tornillos de la empuñadura (Figura 2A, con un círculo rojo).</li>
		<li>Inserte la punta de plástico completamente en la empuñadura. Apriete el tornillo para mantenerlo en su lugar.</li>
		<li>Inserte el tubo de metal en la parte posterior de la empuñadura (Figura 2A). Esto se ajustará, así que insértelo a la mitad de su longitud. Apriete el tornillo para mantenerlo en su lugar.</li>
		<li>Inserte una aguja de tatuaje a través de la parte posterior de la empuñadura para que se asiente cómodamente en la punta de plástico en la parte delantera de la empuñadura (Figura 2B).</li>
		<li>Deslice la parte posterior de la aguja y el tubo de metal a través de la abrazadera del tubo. Ajuste el tubo de metal para que la aguja quepa cómodamente en la punta de plástico (Figura 2B). Apriete a mano la abrazadera del tubo hasta que el tubo no pueda moverse (Figura 2C).</li>
		<li>Retire la junta tórica negra y enganche la aguja en el brazo del rotor; vuelva a colocar la junta tórica para asegurar la aguja en su lugar (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación para que haya suficiente energía para perforar la piel, pero no tan potente como para que sea difícil de controlar. Una vez que la fuente de alimentación esté enchufada y conectada, presione el pedal para asegurarse de que la máquina esté funcionando. Tenga cuidado de no apuntar la aguja hacia usted mismo o hacia otras personas. NOTA: La máquina de tatuar utilizada en este protocolo funciona mejor entre 6.0 y 9.0 V, pero esto puede variar entre las máquinas de tatuar y las fuentes de voltaje y debe determinarse empíricamente.</li>
	<li>Llene la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o un tintero de plástico provisto con tinta negra para tatuajes hasta aproximadamente tres cuartas partes de su capacidad.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Prepare la anestesia en un tanque lo suficientemente grande como para sumergir una rana hembra adulta de X. laevis .<ol><li>Usando agua segura para ranas (sin cloro), agregue tricaína a la concentración final de 1.5 g/L y bicarbonato de sodio a la concentración final de 3.5 g/L. Mezcle para disolver. El pH de esta solución es de 7,15. PRECAUCIÓN: La tricaína es un irritante.</li>
	</ol></li>
	<li>Sumerge una rana en el tanque de anestesia. Asegúrese de que la rana permanezca sumergida en la solución de tricaña hasta que esté anestesiada (7-8 min).<ol><li>Para verificar si la rana está completamente anestesiada, levántela, sujétala boca abajo y apriétala firmemente en una pata. Si la rana no se inmuta ni responde, se puede tatuar.</li>
		<li>Si las ranas tardan más de 10 minutos en ser anestesiadas, prepare una solución fresca de tricaína tamponada con bicarbonato de sodio. NOTA: Las ranas no deben pasar más de 30 minutos en la solución de tricaína15.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tatuaje
NOTA: Antes de tatuar un animal vivo, puede ser útil practicar con una pieza de fruta con una cáscara firme (como un limón o un plátano).
<ol><li>Prepara un tanque de recuperación para las ranas antes de tatuarlas. Llene un tanque con 10-15 L de agua fresca segura para ranas y agregue una isla de espuma de poliestireno. Esto proporcionará una superficie para que la rana se despierte sin ahogarse. NOTA: Se puede hacer una isla de espuma de poliestireno con la tapa de un contenedor de envío frío de espuma de poliestireno colocado dentro de una bolsa con cierre hermético.</li>
	<li>Coloque a la rana anestesiada boca arriba sobre una toalla de papel seca o papel de banco (Figura 3A). Use toallas de papel sin blanquear (marrones) para todo el trabajo que involucre ranas.</li>
	<li>Con una toallita seca sin pelusa, limpia el agua y la mucosidad del pecho de la rana.</li>
	<li>Encuentra el esternón en el centro del pecho de la rana con los dedos y, con la mano no dominante, mantén la piel tensa.</li>
	<li>Marcando la rana<ol><li>Sostenga la pistola de tatuaje ensamblada verticalmente en relación con la superficie de trabajo y sumerja la aguja en la tinta (Figura 3B).</li>
		<li>Manteniendo la pistola de tatuaje montada en posición vertical, presiona la punta de la aguja sobre la piel de la rana antes de pisar el pedal. Dibuja líneas en la piel de la rana mientras aplicas una presión uniforme. NOTA: Es normal que haya un poco de sangrado o enrojecimiento, al igual que un poco de descamación de la piel.</li>
		<li>Si la aguja se engancha en la piel de la rana, limpia el exceso de tinta o piel de la aguja con una toallita. El exceso de tinta es normal durante el tatuaje.</li>
		<li>Si el pecho de la rana está cubierto con demasiada tinta para ver claramente el área que se está marcando (Figura 3C), limpie el exceso de tinta con agua apta para ranas y una toallita (Figura 3C'). Luego, absorba la humedad con una toallita seca y continúe entintando. NOTA: Se puede preparar una botella exprimible de agua apta para ranas antes de tatuar.</li>
		<li>Continúe entintando la misma área hasta que queden oscuros y legibles después de limpiar el exceso de tinta (Figura 3D). En lugar de dibujar toda la marca o el número de un solo trazo, haz repetidamente trazos más pequeños, especialmente para las curvas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recuperación
<ol><li>Moje una toalla de papel con agua apta para ranas y colóquela plana sobre la isla de espuma de poliestireno (Figura 4A).</li>
	<li>Devolver las ranas a los tanques en pie<ol><li>Coloque la rana boca abajo sobre la toalla frente al agua (Figura 4B). Dobla la mitad de la toalla de papel sobre la mitad trasera de la rana y, con las manos ahuecadas, humedece la parte superior de la rana. Una vez que una rana emerge de la anestesia (aproximadamente 1 h después del tatuaje), entrará en el agua de forma independiente y nadará normalmente.</li>
		<li>Regrese las ranas a un alojamiento a largo plazo después de 24 horas, una vez que el tatuaje haya sanado por completo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Limpieza y mantenimiento de equipos
<ol><li>Reutilización y esterilización en autoclave de agujas de tatuaje<ol><li>Enjuague las agujas con isopropanol al 100% y agua desionizada para aflojar la tinta y frotar la tinta restante que no se haya disuelto.</li>
		<li>Después de fregar, coloque las agujas en un estuche metálico para esterilizar en autoclave o envuélvalas con papel de aluminio y autoclave durante 30 minutos en un ciclo seco.</li>
	</ol></li>
	<li>Si hay tinta en pedazos de la máquina de tatuar u otro equipo, límpialo con etanol al 100% y una toalla de papel.</li>
	<li>La solución anestésica tiene una concentración final de tricaína de aproximadamente el 0,5%. Deséchelo de acuerdo con las pautas institucionales de manejo de desechos peligrosos.</li>
	<li>Almacenamiento y mantenimiento de equipos<ol><li>Si es posible, guarda la máquina de tatuar en una habitación seca. El exceso de humedad dañará los componentes eléctricos y reducirá la longevidad de la máquina.</li>
		<li>Para mantener la máquina de tatuar en buen estado de funcionamiento, revise el cojinete del rotor (Figura 2C) para asegurarse de que no se haya soltado por las vibraciones22. Esto se puede apretar con una llave Allen o un destornillador hexagonal.</li>
		<li>Aproximadamente una vez al mes, lubrique el rodamiento en el brazo del rotor con una grasa lubricante espesa22.</li>
		<li>En algunas máquinas de tatuar, el brazo del rotor puede atascarse y no vibrar. Para corregir esto, gire el brazo del rotor o comprima el resorte para que la aguja quede en la posición bajada (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Optimización del marcado de anfibios: una guía para tatuar Xenopus

<ol>
	<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+and+humane+experimental+technique:+Implementing+change.">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals (Basel). 9 (10), 754 (2019).</li><li>Elkan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pregnancy+test.">The Xenopus pregnancy test.</a> British Med J. 2, 1253-1256 (1938).</li><li>Vize, P. D., Zorn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+genomic+data+and+browser+resources.">Xenopus genomic data and browser resources.</a> Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).</li><li>Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus: A Laboratory Manual. , (2023).</li><li>Borodinsky, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+as+a+model+organism+for+the+study+of+spinal+cord+formation,+development,+function+and+regeneration.">Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration.</a> Front Neural Circuits. 11, 90 (2017).</li><li>Hoppler, S., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus:+Experimental+access+to+cardiovascular+development,+regeneration+discovery,+and+cardiovascular+heart-defect+modeling.">Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200 (2020).</li><li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+key+features+and+resources+of+the+Xenopus+model+organism+knowledgebase.">Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase.</a> Genetics. 224 (1), 018 (2023).</li><li>Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+as+a+model+system+to+study+cytoskeletal+dynamics+during+axon+pathfinding.">Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding.</a> Genesis. 55 (1-2), 22994 (2017).</li><li>Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+biology+of+cell+boundary+conditions+through+confinement+of+Xenopus+cell-free+cytoplasmic+extracts.">Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts.</a> Genesis. 55 (1-2), 23013 (2017).</li><li>Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+a+model+for+studies+in+mechanical+stress+and+cell+division.">Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division.</a> Genesis. 55 (1-2), 23004 (2017).</li><li>Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+congenital+kidney+diseases+in+Xenopus+laevis.">Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis.</a> Dis Model Mech. 12 (4), 038604 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Wheeler, G. N., Br&#228;ndli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens:+Lessons+from+zebrafish+and+Xenopus.">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).</li><li>Carron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origin+of+Hox13-dependent+skin+appendages+in+amphibians.">Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians.</a> Nat Commun. 15 (1), 2328 (2024).</li><li>Schultz, T. W., Dawson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housing+and+husbandry+of+Xenopus+for+oocyte+production.">Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production.</a> Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).</li><li>Cadillac, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal identification systems used for mice. , (2006).</li><li>Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+marking+amphibians.">Techniques for marking amphibians.</a> Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , 277-284 (1994).</li><li>Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+implant+fluorescent+marker:+A+reliable+marking+alternative+for+snakes.">Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes.</a> Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).</li><li>Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+identification+methods+for+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).</li><li>Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+of+African+clawed+toads+(Xenopus+laevis).+Improvement+of+a+skin+autograft+technique.">Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique.</a> New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).</li><li>Rodel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis.">Xenopus tropicalis.</a> AmphibiaWeb. , (2001).</li><li>Worldwide Tattoo Supply. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stealth+2+Rotary+Tattoo+Machine+Intro+&amp;+Maintenance.">Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro &amp; Maintenance.</a> Worldwide Tattoo Supply. , (2015).</li><li>Khan, S. U., Mufti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hot+history+and+cold+future+of+brands.">The hot history and cold future of brands.</a> J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).</li><li>Catlett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+About+Lip+Tattoo:+what+to+Expect,+Cost,+Risks,+Touch-ups+&amp;+More.">All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups &amp; More.</a> Healthline. , (2019).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Tatuar humanos es una forma de arte que se remonta a miles de años, y durante el tiempo que los humanos se han tatuado a sí mismos, también han tatuado o marcado animales23. El equipo y las técnicas para marcar animales, en particular mamíferos, están bien establecidos, bien documentados y son ampliamente accesibles. Si bien el marcado de animales fue originalmente para distinguir el ganado y disuadir el robo23, su papel en la investigación biomédica se ha vuelto ig...

Los modelos animales son herramientas útiles para investigar cuestiones relacionadas con la salud humana. En la práctica, la investigación biomédica con modelos animales requiere una organización y un mantenimiento cuidadosos de una colonia animal sana. Las mejores prácticas para el manejo y la cría éticos de animales tienen como objetivo reducir el número de animales necesarios para la experimentación y perfeccionar las prácticas para garantizar el bienestar animal1. El género de ranas con garras, incluyendo Xenopus laevis (X. laevis; Rana africana de garras) y Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Rana de uñas occidental), se han utilizado en la investigación biomédica desde la década de 1930, cuando los médicos sudafricanos utilizaron X. laevis para realizar las primeras pruebas de embarazo2. Si bien las pruebas de embarazo modernas ya no requieren ranas, el papel de la investigación sobre Xenopus persiste. Las ventajas de usar Xenopus para la investigación biomédica incluyen sus genomas bien anotados3, la ovulación inducible durante todo el año de grandes nidadas de huevos4 y huevos puestos externamente susceptibles de fertilización in vitro. Estas características los convierten en un activo útil para la embriología y el desarrollo de vertebrados 5,6,7, la biología molecular y celular básica 7,8,9,10 y para modelar enfermedades humanas 7,11,12,13.
Los métodos fiables para el seguimiento de animales individuales de Xenopus son esenciales para registrar las réplicas biológicas y mejorar el rigor y la reproducibilidad en la investigación. Dado que los Xenopus se alojan con frecuencia en grupos, el marcaje de animales permite a los investigadores rastrear fácilmentea los animales individuales. Mantener un registro preciso de los animales puede ahorrar tiempo y recursos y mejorar la capacidad de realizar un seguimiento de la salud de los animales. Por ejemplo, la identificación individual de animales puede mejorar los flujos de trabajo de organización para generar líneas de Xenopus transgénicos, ya que esto requiere múltiples generaciones de ranas con genotipos específicos verificados por secuenciación14, lo que requiere organización e identificación individual de animales. Esto es particularmente cierto cuando estas mutaciones carecen de fenotipos adultos fácilmente discernibles. Del mismo modo, el uso de ovocitos y embriones de Xenopus para estudiar la biología celular básica y del desarrollo se beneficia del seguimiento de animales individuales. Después de inducir la ovulación, los animales necesitan descansar durante un mínimo de 3 meses para prevenir complicaciones de salud como el síndrome de hiperovulación15. Los métodos de identificación individual garantizan que los animales no sean inducidos a ovular con demasiada frecuencia.
El marcado y el seguimiento de los animales también permiten al personal del laboratorio realizar un seguimiento de los problemas de salud de los animales. El hecho de que los animales del mismo genotipo enfermen puede indicar una endogamia excesiva o problemas de salud imprevistos asociados con el transgén. Del mismo modo, los animales que se enferman después de una ovulación reciente pueden indicar problemas con los reactivos, los materiales o las técnicas. El seguimiento de los animales y su salud permite al personal de laboratorio y a los veterinarios hacer un seguimiento cuando vuelven a surgir preocupaciones y tomar medidas preventivas para prevenir futuras enfermedades. En los mamíferos, existen numerosos métodos de identificación. Los métodos permanentes para ratones incluyen perforaciones en las orejas, marcas en las orejas, tatuajes y microchips subcutáneos16. Estos pueden diferenciar de manera clara y confiable a los animales dentro de una colonia o jaula y pueden ser administrados fácilmente por el personal del laboratorio. Métodos como el punzado de orejas son mínimamente invasivos, requieren solo una pieza de equipo especializado y funcionan para animales de la mayoría de las edades. Si bien estos sistemas son sencillos y útiles para los ratones, su uso en las ranas presenta un conjunto único de desafíos. Las ranas y otros anfibios carecen de pabellón auricular (estructura del oído externo). Algunos investigadores han colocado etiquetas en la mandíbula, el dedo del pie o la extremidad trasera del animal 17,18. Este enfoque dio lugar a varios problemas: las marcas en la mandíbula causaban irritación y las ranas agitadas intentaban arrancar las etiquetas con sus extremidades delanteras17. Las marcas de los dedos perforaban la membrana entre los dedos, lo que perjudicaba el movimiento y conllevaba el riesgo de perderse. Como tal, los anfibios requieren sus propios métodos para su identificación. Históricamente, el corte de los dedos de los pies también se ha utilizado para marcar anfibios17,19. El dedo del pie se corta con un par de tijeras afiladas, y el animal se puede identificar por la longitud de los dedos de las patas delanteras y traseras o por el ángulo en el que el dedo ha vuelto a crecer (en las salamandras). Sin embargo, este método plantea la preocupación ética de que el corte de los dedos de los pies pueda afectar el movimiento del animal17. Además, esto puede causar sangrado e introducir un riesgo de infección. Otro sistema de marcado establecido son los autoinjertos de piel, en los que se toma piel de una parte de la rana y se une quirúrgicamente a otra parte. Por ejemplo, se describe un método para marcar la espalda o el hombro de una rana utilizando un injerto de piel de color claro de su pecho20. Los injertos de piel también conllevan limitaciones y riesgos: el procedimiento es invasivo e introduce el riesgo de infección por Aeromonas hydrophila, o pata roja, una afección potencialmente mortal; La cicatrización completa del autoinjerto tarda hasta 6 semanas; Y con los métodos descritos, solo se pueden alojar 6 ranas juntas debido a que los lugares para colocar un autoinjerto son limitados20.
Los enfoques de marcado menos invasivos incluyen perlas de vidrio y chips de transpondedor17,19. En el método de cuentas de vidrio, las cuentas de vidrio se enhebran en una pequeña sutura y se cosen en la piel de la rana. Esto proporciona una mayor variabilidad que los autoinjertos de piel, con al menos 60 combinaciones de colores distintivas. Sin embargo, existe el riesgo de que la sutura se salga y se pierdan las cuentas. Alternativamente, se puede implantar un transpondedor de microchip debajo de la piel en el saco linfático dorsal de la rana. Este se considera el método de marcaje más permanente y permite identificar y catalogar individualmente un número potencialmente infinito de animales. Sin embargo, este es también el método más caro, ya que los microchips individuales son caros y sería costoso marcar una colonia grande. Los microchips también requieren un escáner especial para leer19. Un enfoque común para la identificación de Xenopus es referirse a la coloración y el patrón natural de los animales. Esto funciona especialmente bien para ranas como X. laevis, que tienen patrones distintos que permanecen durante toda la edad adulta. Sin embargo, estos patrones pueden cambiar con el tiempo con el estrés, y la coloración puede parecer diferente cuando las ranas se muevenentre contenedores transparentes y teñidos. Además, este método de identificación es menos útil para X. tropicalis, que tiene patrones de marca menos distintivos en comparación con X. laevis, o para los animales albinos, que no tienen marcas de color21. Incluso para especies con marcas distintas, el personal del laboratorio puede interpretar la ubicación y el tamaño de las marcas de manera diferente, lo que puede causar errores en la identificación. Debido a esto, fotografiar animales es más confiable junto con un método de identificación adicional. Por lo tanto, buscamos marcar e identificar a los animales Xenopus utilizando una técnica que sea fácilmente discernible, permanente y mínimamente invasiva.
Hay recursos publicados limitados que describen los métodos para tatuar anfibios. El tatuaje se ha descrito junto con otras técnicas de marca, incluidas las marcas de calor, las marcas de nitrato de plata y las marcas de congelación17. En el mismo recurso, el tatuaje se realizó dibujando números con una aguja hipodérmica de 27 G, y se observó que el proceso no causaba infección, en contraste con las otras técnicas de marcado, que usaban un alambre en forma de número u otra marca. En otra fuente, se utilizó una máquina de tatuar eléctrica (descrita como una aguja vibratoria) para marcar ranas, pero se proporcionaron pocos detalles sobre la técnica17,19. Los autores advierten que al perturbar la capa protectora de baba de la rana, este procedimiento aumenta el riesgo de patas rojas. Si bien no existe un método de marcado o identificación que sea completamente no invasivo (como las fotografías) y permanente (como los microchips), el tatuaje proporciona un compromiso efectivo. El tatuaje es relativamente sencillo en comparación con otras técnicas, como los autoinjertos de piel. Los beneficios adicionales incluyen una curva de aprendizaje más pequeña y un equipo relativamente económico. Tatuar anfibios acuáticos conlleva ciertos desafíos, que pueden intimidar a los investigadores y perjudicar el marcaje exitoso de los animales. Este artículo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores métodos bien documentados para tatuar Xenopus adulto con una máquina de tatuar rotativa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1203RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Needle Round Disposable ULTRA</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>HTIPRS5-U</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1205RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1207RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Cord</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkpots</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, delicate task wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA Connection</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>SI101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grips</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>STEALTH2-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam island</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the lid of a styrofoam cold shipping container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>CAUTION: IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unbleached paper towels</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage Supply</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (with frog-safe water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0340923T</td>
			<td>Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X. laevis adult female</td>
			<td>Xenopus1</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip-top plastic bag</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This bag should be large enough to hold the styrofoam island</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for tattooing xenopus laevis with a rotary tattoo machine

Los modelos animales amplían el alcance de la investigación biomédica, lo que mejora nuestra comprensión de la biología del desarrollo, molecular y celular y permite a los investigadores modelar enfermedades humanas. El registro y el seguimiento de animales individuales permite a los investigadores reducir el número de animales necesarios para el estudio y perfeccionar las prácticas para mejorar el bienestar animal. Existen varios métodos bien documentados para marcar y rastrear mamíferos, incluidos los puñetazos en las orejas y las marcas en las orejas. Sin embargo, los métodos para marcar las especies de anfibios acuáticos son limitados, ya que los recursos existentes son obsoletos, ineficaces o prohibitivamente costosos. En este manuscrito, describimos los métodos y las mejores prácticas para marcar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado tatuajes de alta calidad, lo que hace que las personas sean fácilmente distinguibles para los investigadores y representan un riesgo mínimo para la salud de los animales. También destacamos las causas de los tatuajes de mala calidad, que pueden dar lugar a tatuajes que se desvanecen rápidamente y causan daños innecesarios a los animales. Este enfoque permite a los investigadores y veterinarios marcar a los anfibios, lo que les permite rastrear réplicas biológicas y líneas transgénicas y mantener registros precisos de la salud animal.

Los tatuajes de alta calidad tendrán trazos oscuros y legibles en el pecho de la rana y se pueden diferenciar claramente a varios pies de distancia (Figura 5A). En general, los números y marcas más grandes son mejores para la legibilidad, pero los nombres y números más largos se pueden hacer más pequeños para que quepan cómodamente en el pecho de la rana. La longevidad de los tatuajes es más difícil de juzgar, pero los tatuajes de ranas de alta calidad deben permanecer oscuros y le...

Autor destacado: Refinamiento de técnicas de marcado de Xenopus laevis para estudios biomédicos

Aquí, describimos métodos para tatuar Xenopus laevis adulto (rana africana con garras) con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado números oscuros y fácilmente legibles que duran varios meses y hacen que los animales se distingan fácilmente para fines de investigación y mantenimiento de registros.

Métodos para tatuar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

methods-for-tattooing-xenopus-laevis-with-a-rotary-tattoo-machine

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

548 vistas.  Dartmouth College. Nuestra investigación se centra en investigar la organización de la corteza celular utilizando extractos de huevo de Xenopus y bicapas lipídicas soportadas. Estamos tratando de entender cómo se regulan los patrones dinámicos del citoesqueleto dentro de la corteza y cómo estos patrones apoyan las funciones celulares básicas como la división celular. Este protocolo describe un método eficaz y seguro para marcar Xenopus laevis.Este enfoque permit...

Video: Autor destacado: Refinamiento de técnicas de marcado de Xenopus laevis para estudios biomédicos

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Investigación

Biología

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

La obtención de huevos de Xenopus laevis mujeres

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker Software a Medida microtúbulos dinámica en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Conos de Crecimiento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...