Este trabajo fue apoyado por becas de Investigación para Prevención de la Ceguera (Premios de Desarrollo Profesional para MEZ y ASV y una beca para el Departamento de Oftalmología), la Fundación E. Matilda Ziegler (MEZ y ASV) y el National Eye Institute / NIH (MEZ , las subvenciones y R01EY015748 R01EY017964).

Parte I. La configuración para el ensayo ACT <ol><li> Generar ARN tope para la inyección según lo sugerido por el fabricante, utilizando sus fenol: cloroformo método de purificación (por ejemplo, mMessage mMachine Kit, Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). ARN que codifica una proteína fluorescente se utiliza como trazador. Transcribimos cualquier proteína amarilla fluorescente (YFP) o mCherry 5 cDNA, que se encuentra en un vector de expresión pCS2 +. </li><li> Tire de los tubos de vidrio borosilicato capilares para formar puntas cónicas de vidrio utilizando un extractor de micropipeta. Usamos Sutter Micropipeta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), como se describió anteriormente 6. </li><li> Que las soluciones estériles en la Tabla 1 de un 10 X de Marc de modificación del timbre (MMR) solución madre (10 mM de MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, HEPES 50 mM, NaCl 1 M, ajustada a pH 7,5, autoclave y se almacena a RT). </li><li> Aislar a los testículos de una rana macho y almacenar el tejido a 4 ° C en una solución estéril de 1X MMR / gentamicina (50 mg / ml de sulfato de gentamicina; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Esto se puede hacer hasta una semana antes del inicio del experimento, pero es pierde su eficacia con el tiempo. </li><li> Solución de la puesta de huevos (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma base, 2,62 mM NaHCO3 y 2,75 mM MgSO 4, se ajusta a pH 7,6) se puede hacer como una acción de 8x, que se puede almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Nota: ten cuidado con la contaminación en esta solución, ya que esto afectará la calidad de sus óvulos. </li><li> Generar las placas de la inyección. Para ello, se funden agarosa al 1% en 0,4 x MMR en un horno de microondas, añadir ~ 6 mL de solución agarosa derretida en 60 placas mm, suavemente desenrollar un molde de elastómero (Figura 1) en la parte superior de la solución para evitar las burbujas y dejar enfriar por unos 20 minutos a temperatura ambiente. Para determinar el número necesario, considerar el número de condiciones experimentales (por ejemplo 1, YFP, 2, YFP Noggin +) y es necesario el número de embriones transplantados de host. Para nuestros experimentos, generar por lo menos 20 embriones transplantados de host para cada condición experimental. A 18-19 ° C, los embriones serán en la etapa 15 por una hora. Si se toma una hora para llevar a cabo 20 trasplantes, a continuación, dos momentos de fertilización se necesitan, asumiendo que los embriones de acogida aceptará todos los trasplantes. Por lo tanto, cuatro platos de inyección será necesaria (2 x 2 exp condiciones de los puntos de tiempo fertilización = 4). Almacenar las placas a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li><li> Generar las placas de aislamiento con tapa de agarosa al 1% + 0.7X MMR con los moldes en cuanto a la placa de la inyección. Hacer el mismo número de aislamiento de la PAC como placas inyección y un punto extra por el tiempo de fertilización (4 + 2 puntos de tiempo fertilización = 6). </li><li> Inyectar las hembras con 500 unidades de gonadotropina coriónica humana al final del día el día antes de la microinyección. Mujeres almacenar a 16-18 ° C durante la noche. </li></ol> Parte II. ARN Microinyección de embriones de Xenopus laevis A. Preparación para la microinyección <ol><li> Quitar las mujeres hormonalmente inducida y colocarlos en jaulas individuales que contiene 1X solución de puesta de huevos (ELS). Nota: no usamos los huevos que han estado en el ELS más de dos horas como la calidad de los huevos se reduce. Por lo tanto, una hora antes de la fecundación in vitro, se descartan todos los huevos en el tanque de modo que los huevos recién puestos sólo se recogen. </li><li> Prepare la aguja para la microinyección cortando la punta para obtener un diámetro de 25-35 micras. Coloque la aguja en la picoinjector y calibrar de modo que se prescinde de 10 nl por inyección. </li><li> Establecer una incubadora a 14 ° C. </li><li> Una vez que las hembras han puesto huevos durante aproximadamente una hora, retirar los óvulos del tanque utilizando una pipeta de transferencia y los situará en 60 mm placas de Petri. Eliminar la mayor cantidad de ELS de los huevos como sea posible y vuelva a colocar con 1X MMR. Los huevos pueden ser fertilizados inmediatamente o permanecer en el MMR 1X para un máximo de una hora. Para el ensayo de trasplante, lo mejor es fertilizar dos platos, el 80% de su capacidad de una sola capa de huevos en un máximo de tres lotes separados alrededor de las 11 am, al mediodía y la 1 pm. Después de la inyección, que será colocado a 14 ° C para que puedan llegar a las etapas que desee para el aislamiento de la tapa (etapa 8,5-9) y el trasplante (la etapa 15, véase la Parte I, # 6). </li><li> Para comprobar la calidad de los testículos, se realiza una fertilización mañana temprano (~ 8 am), lo que nos permite extraer los testículos de otro hombre, si el esperma de la primera no es viable. Nota: ~ 0,25 homogeneizar los testículos en una MMR mL 1X y añadir aproximadamente 5 a 7 gotas por la placa de los ovocitos. </li><li> In vitro fertilizar los huevos con testículos homogeneizada y, una hora más tarde, eliminar la capa gelatinosa de los huevos con jalea de solución (164μl 1M TDT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 hasta 50 ml de agua Nanopure autoclave). Espere hasta que llegan a la etapa de dos células para comenzar la clasificación, que dura aproximadamente 2 horas a 18 ° C o 1,5 horas a temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> El uso de un transfer pipeta, embriones tipo uniformemente pigmentados y dividiendo por igual, como se muestra en la tapa de los animales a la izquierda en la figura 3, en el pozo de inyección de un plato lleno de 0,4 x Ficoll MMR + 6%. </li></ol> B. microinyección <ol><li> Parafilm tramo en la parte superior de una tapa de plato de Petri de 60 mm. Pipetear 2 l de la primera muestra de ARN en el Parafilm y se aspira con el PLI-100 para cubrir la aguja de la inyección. Asegúrese de verificar que la aguja está todavía dispensación 10 nl de la muestra antes de comenzar la inyección. </li><li> 20-30 inyectar dos células de embriones etapa (dos blastómeros) con 500 pg de ARN YFP en un plato y el gen de interés (por ejemplo, 20 pg Noggin ARN), además de ARN YFP en otro plato 7. </li><li> 100-200 lugar no inyecta embriones por cada punto de tiempo en el otro plato de la inyección con la solución de Ficoll. Moverlos dentro y fuera de la incubadora a la vez que los embriones inyectados. Estos son los anfitriones que se utilizan en la Parte IV. </li><li> Después de la inyección, todos los embriones se incuban a 14 ° C durante la noche. Repita este procedimiento para todos los tiempos. </li></ol> Parte III. Aislar a las tapas de los animales a partir de embriones inyectados <ol><li> Llegue temprano en la mañana a la etapa de los embriones. El menor período de tiempo debe estar en la etapa 9. Eliminar aquellos que no sobrevivieron. Continúe con los pasos siguientes de trabajo con cada punto del tiempo en lotes. </li><li> Retirar la solución de Ficoll de cada plato y añadir de nuevo MMR 0.7X / solución de gentamicina. A un plato de aislamiento de tapa, añadir una cantidad generosa de 0.7X MMR / gentamicina solución. Desalojar a los embriones de los pozos de inyección de plato con una pipeta de transferencia y el lugar en el plato de tapa de aislamiento recién preparada. </li><li> Aislar a las tapas de los animales en 0.7X MMR + solución de gentamicina, mantener 2 ó 3 embriones intactos para la estadificación. O bien el Gastromaster, equipado con una punta amarilla doblada a 400 micras, o un par de pinzas afiladas número 5 se puede utilizar. </li><li> Ponga las tapas en 14 ° C incubadora hasta el día siguiente. Los embriones de acogida deben ser retirados de la incubadora, al mismo tiempo como las tapas para evitar que en la misma etapa de desarrollo como el tejido de un donante. </li></ol> Parte IV. El trasplante de tapas en el flanco <ol><li> Quite las tapas y los embriones desde el punto de primera vez de los 14 ° C incubadora y la etapa de los embriones. Clasificar para el uniforme de color amarillo o rojo fluorescente-positivas las tapas, en función de la inyección del trazador (Figura 2). </li><li> Cuente el número de tapas y eliminar el doble del número de la etapa 12-13 embriones a un plato de inyección recién preparada con 0.7X MMR / solución de gentamicina. Con unas pinzas afiladas # 5, quitar la membrana vitelina de cada uno. Transferirlos a la plancha con los tapones, pero tenga cuidado. Sin su membrana vitelina, los embriones se puede disociar rápidamente en la superficie del agua. </li><li> Utilizando el gastromaster (punta amarilla, 200 250 micras alambre doblado, valor más alto) o # 5 pinzas, quite una de 200 micras cuadradas en la parte del embrión en la etapa 14-15 (Figura 3). Luego, cortar una tapa en la mitad (con la gastromaster o las pinzas # 5) y colocar el tejido en el agujero hecho en el embrión de acogida. Gire el embrión contra el bien para permitir la cicatrización. Haga esto para los embriones que puedas mientras están en la etapa 15. Repita este procedimiento para todos los tiempos. </li><li> El embrión usualmente sanan en un lapso de 30 minutos. Eliminar las células muertas (blancas) con un movimiento de cepillado suave con un fórceps # 5. Ellos crecen a 18 ° C durante la noche. </li><li> Bajo la lupa de fluorescencia, los embriones de tipo fluorescente con la etiqueta, el tejido trasplantado. Ponerlos de nuevo a 18 ° C para crecer hasta la etapa 42-43. </li><li> Anestesiar a los animales en tricaína. En este punto, usted puede tomar fotos debajo de un microscopio de fluorescencia de disección. Una vez haya terminado, fijar, sección y inmunotinción o llevar a cabo la hibridación in situ utilizando marcadores para tejido de interés. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diseño de plexiglás para la fundición del molde elastómero utilizado para la fabricación de platos embrión explotación. A 38 x 38 mm con las esquinas redondeadas cuadrados (~ 5 mm de profundidad), ha sido derrotado por un pedazo de plexiglás que es de 50 x 50 mm de lado y 25 mm de espesor. Circular, los pozos espaciados uniformemente (1,5 mm de diámetro) se han perforado 1 mm de profundidad en el plástico. Para hacer el molde de elastómero para los platos de microinyección, se vierte elastómero Sylgard en el plexiglás y permite que se solidifique, según las instrucciones del fabricante. Este molde elastómero se utiliza para hacer la inyección y las placas de tapa de aislamiento. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Tapa de la clasificación de los animales antes del trasplante es importante, ya que la expresión puede variar. Tapa de animales de la izquierda expresa mCherry uniformemente a través de los tejidos, mientras que el explante de la derecha tiene la expresión irregular y no se tiene. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A tadp anfitriónole ha desarrollado una estructura con forma de ojo en su flanco de trasplantes de células de animales de la PAC. Una imagen fluorescente se ha superpuesto en la imagen de campo claro.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

En este video, hemos demostrado nuestra versión de las técnicas clásicas utilizadas por los biólogos de Xenopus, que reorganizan para crear la tapa de los animales del ensayo de transplante. A temperatura ambiente, los embriones de Xenopus se desarrollan muy rápidamente a través de las etapas 9 y 15. Poniéndolos a 14 ° C, el desarrollo del embrión es más lento y muchos más trasplantes se pueden realizar en un experimento. Si es necesario hacer crecer los embriones a los mayores niveles (&gt;...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

Muchas proteínas juegan un doble papel en el desarrollo embrionario. Las que regulan la determinación de destino celular en un tejido específico también puede afectar el desarrollo de una región más grande del embrión. Esto hace que la definición de su papel en un determinado tejido difícil de analizar. Por ejemplo,<em&gt; Bocha</em&gt; Sobreexpresión en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriones provoca la expansión de la región anterior completo, incluyendo el ojo<sup&gt; 1,2</sup&gt;. A partir de este resultado, no se sabe si Noggin desempeña un papel directo en la determinación de los ojos o que al causar una expansión del tejido neural, Noggin indirectamente afecta a la formación del ojo. Tener este fenotipo complejo hace que el estudio de sus ojos-papel específico en la determinación del destino de las células difíciles de analizar. Hemos desarrollado un análisis que supera este problema. Tomando ventaja de la naturaleza potente de la<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Animal tapa<sup&gt; 3</sup&gt;, Hemos desarrollado un ensayo para probar la capacidad del producto génico (s), como<em&gt; Bocha</em&gt; O los factores de transcripción de campo visual (EFTFs), para transformar las tapas en los tejidos o tipos celulares mediante el trasplante de este tejido en la parte del embrión<sup&gt; 4</sup&gt;. Si bien hemos encontrado ninguno de los tratamientos de proteína Noggin o un conjunto de factores de transcripción se puede determinar el destino de células de la retina en las tapas de los animales, este procedimiento podría ser utilizado para identificar productos génicos (s) involucrados en la especificación de otros tejidos.

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animales que sobreexpresan genes tapas de producto (s), se trasplanta al costado de desarrollo<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriones con el fin de establecer si el tejido está determinada.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.1K vistas.  SUNY Upstate Medical University. Animales que sobreexpresan genes tapas de producto (s), se trasplanta al costado de desarrollo Xenopus laevis Embriones con el fin de establecer si el tejido está determinada.

Video: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Investigación

Biología

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

La obtención de huevos de Xenopus laevis mujeres

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

La producción de transgénicos Xenopus laevis Integración mediada por la enzima de restricción y transferencia nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker Software a Medida microtúbulos dinámica en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Conos de Crecimiento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...