Damos las gracias a David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, Columbia Británica) para la prestación del baculovirus AcMNPV y útil para el debate. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), el Michael Smith Fundación para la Investigación en Salud (MSFHR), y el de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) .

Parte 1: Preparación de los ovocitos de Xenopus para la microinyección <ol><li> Coloque una pequeña porción (alrededor de 2 cm) de Xenopus ovario laevis en un tubo cónico de 50 ml que contienen 20 ml de solución de colagenasa (5 mg / ml de colagenasa en calcio sin modificar Barth salina: 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenasa se utiliza para eliminar las células del folículo que rodean a los ovocitos. </li><li> Coloque el tubo en una plataforma de agitación y el rock con suavidad (a 100 rpm) durante una hora. Este tiempo varía con los diferentes lotes de la colagenasa. Así, después de una hora, tomar una pequeña muestra de los ovocitos y examinarlas bajo un microscopio de disección. Adecuadamente de-folliculated ovocitos deben estar bien separados unos de otros, y debe ser fácil de insertar una aguja de vidrio en el oocito. Si los óvulos no son lo suficientemente de-folliculated, se quedan en la solución de colagenasa y comprueba de nuevo cada cinco minutos. </li><li> Lavado de los ovocitos tres veces con solución salina modificada de Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7,5), y la transferencia de los a 100 mm de diámetro del plato de Petri que contiene MBS más el 1% de penicilina estreptomicina /. Los ovocitos están listos para ser microinyección. Si microinyección se llevará a cabo en otro día, tienda de los ovocitos a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, seleccionar ovocitos maduros VI etapa para la microinyección. Estos ovocitos son grandes, con buen contraste entre el hemisferio negro de origen animal y vegetal del hemisferio color crema. </li><li> La transferencia de los ovocitos maduros etapa VI en una placa de microtitulación (Nunc, un volumen de 10 l bien). Esto debe hacerse con cuidado, usando una pipeta de 200 ml con una pipeta de punta que se ha cortado al final para permitir la succión ininterrumpido de los ovocitos. </li></ol> Parte 2: La microinyección de ovocitos de Xenopus <ol><li> Prepare el sustrato de importación que se microinyección mediante la adición de una pequeña cantidad de 1% de azul de bromofenol, para ayudar en la visualización de la microinyección. Por ejemplo, podemos añadir 1 l de azul de bromofenol y 10 l de sustrato. </li><li> Coloque una pequeña tira de Parafilm en una de 100 mm diámetro del plato de Petri, y prescindir de una caída del 5-l de la solución que se inyecta en la tira de Parafilm. </li><li> Llene una aguja de inyección previamente calibrado (que se obtiene tirando de un 6,6 l micropipeta Drummond con el Inyectar + Matic asistente de cámara) con la solución a inyectar. Para ello, el microinyector se encuentra en el modo de aspiración. Para calibrar la aguja que marca puntos en la aguja cada 0,5 mm, que corresponden a un volumen de 50 nl. </li><li> Para la inyección citoplasmática, inserte la punta de la aguja en un ovocito en el hemisferio vegetal, muy cerca del hemisferio animal, en un ángulo de aproximadamente 45 grados. A su vez la creación de microinyector microinject y microinject cada ovocito con 50 nl de sustrato de importación. Las marcas de puntos en la aguja se utilizan para controlar la cantidad de sustrato que se ha inyectado. </li><li> La transferencia de los óvulos inyectados a un pequeño (35 mm de diámetro) una placa de Petri llena de MBS, e incubar a temperatura ambiente durante el tiempo deseado (puntos de tiempo se eligen con el fin de permitir la observación del sustrato de importación asociados con los NPCs, lo que ocurre entre 10 y 30 minutos para las proteínas y los virus que son transportados activamente a la Asamblea Popular Nacional, esta vez también depende del sitio de la inyección y el tamaño de la proteína / virus). </li><li> Cuando la incubación, la transferencia de ovocitos a un vial de vidrio de 4 ml que contiene 2% de glutaraldehído en el MBS y la solución de la noche a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Disección de los ovocitos de Xenopus <ol><li> Al día siguiente, lave los ovocitos 3 veces con MBS. </li><li> La transferencia de ovocitos a una pequeña placa de Petri llenas de sal de amortiguación bajo (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,5). El uso de un microscopio de disección y pinzas de disección, retirar el polo vegetal de cada ovocito. Es útil para estabilizar el ovocito se analizó con un par de pinzas, mientras que el otro par se utiliza como tijeras para cortar el polo vegetal. En este punto es posible evaluar el éxito de la microinyección por la presencia de un tinte azul en el citosol. El protocolo se mantendrán solamente por los ovocitos que se microinyección con éxito. Además, si las muestras se prepararán para EM, este paso disección hace que sea mucho más fácil encontrar el núcleo cuando se poda y el corte de las muestras. </li><li> Fijar los ovocitos disecados de nuevo con glutaraldehído al 2% en LSB durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Después de la fijación, lavado de los ovocitos diseccionado en tres ocasiones con la LSB. </li></ol> Parte 4: Preparación de los ovocitos inyectados para la Incorporación de EM y delgada de seccionamiento <ol><li> La transferencia de los ovocitos disecados a una diapositiva depresión. Aspirar la mayor cantidad de líquido como seaposible, y luego rápidamente (para que no se sequen) cubren los ovocitos analizó con bajo punto de fusión agarosa al 2%. Mientras que la agarosa es todavía suave, use una punta de pipeta para separar los ovocitos de los demás, y para asegurarse de que cada ovocito está boca arriba o hacia abajo (no hacia los lados). </li><li> Deje que la agarosa para solidificar durante unos 10 minutos. Una vez que la agarosa se solidifica, use una hoja de afeitar para cortar la agarosa en trozos pequeños, cada uno con un ovocito disecados. </li><li> Coloque los ovocitos de agarosa incrustado en un frasco de vidrio de 4 ml, y los post-solución con un 1% OsO 4 en LSB durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la muestra tres veces en la LSB. Si es necesario, guardar la muestra a 4 ° C durante la noche y continuar con el protocolo al día siguiente. </li><li> Secuencialmente deshidratar las muestras en una serie ascendente de alcohol (50, 70 y 90% de etanol durante 20 minutos cada uno). Esto es seguido por dos cambios en el 100% de etanol durante 15 minutos cada uno. Finalmente se deshidratan las muestras con acetona al 100% durante 15 min. </li><li> Infiltrarse en las muestras con una mezcla de 1:1 de Epon (Fluka) y acetona durante una hora, seguido por la infiltración con una mezcla de 2:1 de Epon y acetona durante dos horas, y finalmente en pura Epon por lo menos seis horas. </li><li> Colocar las muestras en moldes incorporación plana llena de frescos Epon puro. Los ovocitos están orientadas de tal forma que el lado del núcleo más cercano al lugar de la inyección - en este caso del lado de los ovocitos que se ha dividido - serán distribuidos en primer lugar. Este paso sirve para optimizar las posibilidades de visualización de las importaciones del sustrato elegido. </li><li> Por último, polimerizar el Epon durante dos días a 60 ° C. </li><li> Con el fin de visualizar las muestras, los bloques se cortan y se secciona a continuación, utilizando una ultramicrotomo. Las secciones son transferidos a las redes de EM, teñidas utilizando el procedimiento estándar, y se visualizaron con un microscopio electrónico de transmisión. No vamos a mostrar esta parte del protocolo, ya que es el procedimiento estándar de EM. </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: Si el protocolo ha sido un éxito, entonces la envoltura nuclear (NE) y el CPN debe ser claramente visible en micrografías EM. Dependiendo de la inyección del sustrato y la cantidad de tiempo entre la inyección y la fijación, el sustrato debe ser visible en la cara citoplásmica de la APN, en la Asamblea Popular Nacional, o en el frente nuclear de la APN. La figura 1 muestra una sección transversal NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con cápsides de los baculovirus AcMNPV, se incubaron a 4 ° C durante cuatro horas, y se procesaron para inclusión y corte delgado EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Un acoplamiento cápside en la cara citoplásmica de un NPC se indica con una flecha blanca. En contraste, la figura 2 muestra una sección transversal NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con el virus de parvovirus Minuto de ratones (MVM), incubados a temperatura ambiente durante cuatro horas, y procesados ​​para inclusión y la sección delgada EM como se describe. Usando esta técnica, hemos encontrado que MVM induce alteraciones de la NE (Cohen y Pante, 2005). Paréntesis indican los saltos en el NE. Puntas de flecha a punto de NPCs. Cápsides putativo MVM asociado con la NE se indican con flechas blancas. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figura 1" width="600" height="459" /> Figura 1: Micrografía electrónica de una sección NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con cápsides de los baculovirus Ac MNPV, se incubaron a 4 ° C durante cuatro horas, y se procesaron para incorporación de la sección delgada y EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Cápsides se indican con flechas blancas. Barra de escala: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="264" /> Figura 2: Micrografía electrónica de una sección NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con el virus de parvovirus Minuto de ratones (MVM), incubados a temperatura ambiente durante cuatro horas, y procesados ​​para inclusión y la sección delgada EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Paréntesis indican los saltos en el NE. Cápsides putativo MVM asociado con la NE se indican con flechas blancas. Barra de escala: 100 nm.

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	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Microinyección de ovocitos de Xenopus combinado con finas corte EM es una herramienta muy eficaz para el estudio de transporte nucleocytoplasmic. Este sistema ha sido utilizado para asignar los distintos pasos de la importación a través de la APN, por ejemplo de interacción de un sustrato de importación nuclear con componentes estructurales de la APN, tales como los filamentos de citoplasma y una canasta nuclear (revisado por Pante, 2006). También se ha utilizado para estudiar la importación nuclear de l...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis seguido por el corte fino de microscopía electrónica (EM) es un excelente sistema para estudiar el transporte nucleocytoplasmic. Debido a su gran núcleo de alta densidad y de los complejos de poro nuclear (CPN), el transporte nuclear puede verse fácilmente en el ovocito de Xenopus. Mucho conocimiento de los mecanismos de importación y exportación nuclear se ha ganado a través del uso de este sistema (revisado por Pante, 2006). Además, hemos utilizado la microinyección de ovocitos de Xenopus a diseccionar las vías de importación nuclear de varios virus que se replican en el núcleo principal. Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de los ovocitos de Xenopus con un sustrato de importación nuclear. También muestran la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización de corte fino EM, incluyendo la disección, la deshidratación, y la incorporación de los ovocitos en una resina epoxi incrustación. Por último, se ofrecen los resultados representativos de los ovocitos que se han microinyección con la cápside del nucleopoliedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o el virus del parvovirus Minuto de ratones (MVM), y discutir las posibles aplicaciones de la técnica.

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Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Ovocitos con un sustrato de importación nuclear, así como la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización por microscopía electrónica de corte fino.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K vistas.  University of British Columbia - UBC. Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de Xenopus laevis Ovocitos con un sustrato de importación nuclear, así como la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización por microscopía electrónica de corte fino.

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Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Investigación

Biología

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

La obtención de huevos de Xenopus laevis mujeres

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker Software a Medida microtúbulos dinámica en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Conos de Crecimiento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...