Aislamiento de exosomas de células de cáncer epitelial de ovario de ratón para generar un parche de microagujas

Para comenzar, tome células epiteliales de cáncer epitelial de ovario de ratón cultivadas. Retire el medio de cultivo de las placas de Petri y lávelas dos veces con DPBS. Agregue 20 mililitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium sin FBS y solución de penicilina-estreptomicina.

Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. A continuación, recoja el sobrenadante de cultivo celular de 20 placas de Petri de 15 centímetros de diámetro. Centrifugar a 300 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante.

Centrifugar el sobrenadante a 2.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante para eliminar los restos celulares. Ahora encienda la bomba de vacío y conéctela a la entrada de aire del sistema de filtración al vacío. Filtre el sobrenadante a través de la membrana de polietersulfona de 0,22 micras para eliminar vesículas o impurezas de más de 0,22 micras.

Agregue 15 mililitros del sobrenadante filtrado al tubo interior del tubo de ultrafiltración de 100 kilodalton. Centrifugar a 3.500 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el líquido del tubo exterior.

A continuación, recoge el líquido de la cámara de aire. Agregue un mililitro de DPBS a la cámara de aire. Pipetear repetidamente para resuspender los exosomas y, a continuación, recogerlos.

Centrifugar el líquido a 10.000 g durante 60 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga rápida de seis mililitros y séllelo con un sellador térmico. Abra el tubo después de ultracentrifugar el sobrenadante durante dos horas.

Una vez retirado el sobrenadante, se vuelve a suspender el pellet en 100 microlitros de DPBS para obtener la solución de exosoma.