Ensamblaje y recocido de dúplex de ácidos nucleicos para caracterizar el procesamiento enzimático de ADN con oligonucleótidos modificados

Para comenzar, centrifuga el tubo que contiene oligonucleótidos liofilizados a toda velocidad en una centrífuga de sobremesa durante dos a cinco minutos. Vuelva a suspender los oligonucleótidos en el tampón TE para preparar un material maestro de 100 micromolares y vórtice suavemente el tubo. Diluir una alícuota de material maestro con tampón TE para preparar un material de 10 micromolares y preparar la mezcla maestra de reacción.

Después de dispensar la mezcla a los tubos requeridos, recociendo los oligonucleótidos en un termociclador a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos a una hora. A continuación, añada los cofactores de nucleótidos y otros componentes tampón sensibles al calor a la mezcla maestra.

Si es necesario, almacene la mezcla a 20 grados centígrados para usarla en el futuro. Combine 22,5 microlitros de la mezcla maestra de sustrato con 2,5 microlitros de la ADN ligasa en un tubo de PCR. Coloque inmediatamente los tubos de reacción en una máquina de PCR a 25 grados centígrados durante 30 minutos.

Para apagar la reacción, agregue cinco microlitros de tinte de carga e incube a 95 grados centígrados durante cinco minutos.