Este protocolo proporciona una alternativa poderosa para el cribado de la actividad de la nucleasa como biomarcador de la enfermedad, con una metodología fácil de implementar incluso para investigadores que no están tan especializados en sondas de ácido nucleico. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de seleccionar sondas de ácido nucleico que pueden identificar actividades de nucleasa conocidas y desconocidas, aprovechando la interacción dinámica sonda-nucleasa. Otras ventajas de esta metodología son su flexibilidad, alta reproducibilidad y facilidad de uso.
La demostración será realizada por Khadija, un estudiante de maestría, y Baris, un postdoctorado de nuestro laboratorio. Al diseñar una biblioteca de oligonucleótidos, incluya al menos un ADN y una secuencia aleatoria de ARN que contenga una combinación de adenina, guanina, citosina y tiamina o uracilo. Para preparar las sondas de oligonucleótidos, gire hacia abajo las sondas de oligonucleótidos liofilizados y diluya cada sonda en el tampón Tris-EDTA a una concentración de 500 picomolar por microlitro para evitar la degradación de la nucleasa.
Para el cultivo bacteriano en medio sólido, enrolle un solo cordón de vidrio poroso de almacenamiento criogénico directamente sobre un plato de cultivo que contenga TSA complementado con sangre de oveja desfibrinada para rayar colonias bacterianas individuales. A continuación, coloque la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para el cultivo bacteriano en medio líquido, transfiera una sola colonia de un cultivo medio sólido a 50 mililitros de TSB para incubación a 37 grados centígrados durante 24 horas a 200 rotaciones por minuto.
Al día siguiente, diluir el cultivo a una proporción de uno a 500 en TSB fresco e incubar las bacterias durante 24 horas adicionales a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto en una incubadora de temblores. Para configurar un ensayo de actividad de nucleasa, primero precalentar un fluorómetro a 37 grados Celsius y añadir cuidadosamente 96 microlitros de TSB estéril o sobrenadante de un cultivo medio líquido de Salmonella o E.coli a un tubo de microcentrífuga sin nuclelisilitro de 1,5 mililitros por sonda. Agregue cuatro microlitros de solución de trabajo de sonda a cada tubo y utilice una pipeta para mezclar a fondo cada contenido del tubo hasta que se logren soluciones homogéneas, teniendo cuidado de evitar burbujas.
A continuación, cargue cuidadosamente 95 microlitros de cada solución cerca de la pared de pozos individuales de un fondo negro, placa de 96 pozos no tratada, teniendo cuidado de evitar burbujas. Una vez añadidas todas las soluciones, cubra la placa e inspeccione visualmente la tapa en busca de marcas de plumas o polvo que puedan introducir artefactos de medición. Para configurar el software para la medición de la actividad de la nucleasa, abra un programa de software de adquisición adecuado.
Seleccione Leer ahora en la ventana Administrador de tareas y seleccione Nuevo para crear el protocolo de medición cinética. Haga clic en Establecer temperatura para seleccionar 37 grados centígrados y confirmar y guardar la configuración haciendo clic en Aceptar. Haga clic en Iniciar cinética. En la ventana emergente, seleccione dos horas en el cuadro de entrada Tiempo de ejecución y dos minutos en el cuadro de entrada de intervalo antes de hacer clic en Aceptar para confirmar y guardar la configuración.
Haga clic en Leer. En la ventana emergente, seleccione Intensidad de fluorescencia como Método de detección, Punto final Kinético como Tipo de lectura y Filtros como Tipo de óptica. A continuación, haga clic en Aceptar. En la ventana emergente, seleccione Verde en el conjunto de filtros y haga clic en Aceptar. En la ventana Procedimiento, seleccione Usar tapa y haga clic en Validar.
Aparecerá una ventana emergente que confirma que el protocolo creado es válido. En el menú Protocolo, seleccione Procedimiento. En la ventana Procedimiento, defina los pozos que se van a medir e introduzca el nombre del experimento en el cuadro de entrada Nombre de archivo.
A continuación, cargue la placa en el lector de placas, teniendo cuidado de que la placa esté en la orientación correcta y haga clic en el botón Leer nuevo para comenzar la adquisición. Para el análisis de datos, abra los datos en el software de análisis adecuado y seleccione uno de los pozos medidos en la placa una ventana. Haga clic en Seleccionar pozos e incluya todos los pozos medidos en la ventana Diálogo de selección de pozos antes de hacer clic en Aceptar. A continuación, seleccione Datos en la placa una ventana para visualizar los resultados tabulados y haga clic en QuickExport para exportar los datos a una hoja de cálculo.
En una hoja de cálculo, etiquete las columnas de datos según corresponda para cada muestra y sondeo, y trace las unidades de fluorescencia relativas frente al tiempo para que los datos generen gráficos cinéticos. En este experimento representativo, después de la primera ronda de cribado, los sobrenadantes del cultivo de Salmonella reportaron una clara preferencia por las sondas de ARN sobre las sondas de ADN. Sobre la base de la identificación del ARN como el tipo de ácido nucleico preferido por las nucleas de Salmonella, una nueva biblioteca solo de ARN está diseñada para ser utilizada en la segunda ronda de cribado.
Por el contrario, E. coli en los controles de medios de cultivo demostró una capacidad muy limitada para degradar las sondas de ARN. Después de una segunda ronda de cribado utilizando nucleótidos modificados químicamente con el objetivo de aumentar la especificidad de las sondas de ARN, el ARN pirimidina 2'O-metil y ARN purina 2'O-purilo podrían identificarse sobre la base de sus modificaciones químicas como que presentan el mejor comportamiento cinético de rendimiento en comparación con el ARN pirimidina 2'fluoro y ARNina 2'fluoro respectivamente. Estos resultados sugieren que Salmonella tiene una actividad importante de RNAse con preferencia química de sustrato diferencial que se puede utilizar para seleccionar sondas capaces de reconocer específicamente esta bacteria.
Este procedimiento permite la selección de sondas que son capaces de identificar las actividades de nucleasa asociadas con las condiciones de la enfermedad, como el cáncer o la infección bacteriana, permitiendo el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico clínico.
