Para comenzar, coloque el medio de expansión recién preparado, filtre las soluciones de proteinasa y antibióticos esterilizados y los instrumentos quirúrgicos esterilizados en la plataforma de trabajo del gabinete de bioseguridad. Agregue colágeno de cola de rata en placas de cultivo de 100 milímetros y pocillos trans de 24 milímetros. Deje los platos abiertos durante la noche bajo luz ultravioleta para su esterilización.
Sumerja el ratón sacrificado en etanol al 75% para su esterilización. No sumerja la nariz ni la boca. Con tijeras quirúrgicas y pinzas, corte y abra la epidermis desde la mandíbula inferior hasta la cavidad abdominal del ratón.
Con otro juego de tijeras quirúrgicas y fórceps, desgarre las glándulas tiroides de ambos lados y retire las conexiones entre la tráquea, el tejido muscular circundante y el esófago. A continuación, corte con cuidado el pecho y utilice unas pinzas para profundizar en la cavidad torácica. Extirpa todo el pulmón y encuentra el extremo de la tráquea.
Corte la tráquea desde el cartílago tiroideo hasta la rama bronquial traqueal y colóquela en un medio de expansión previo al frío que contenga cuatro antibióticos. Agite el tubo para enjuagar la mayor cantidad de sangre posible de la superficie de la tráquea antes de colocarlo en hielo. Ahora transfiera la tráquea a un PBS pre frío que contiene cuatro antibióticos.
Con tijeras quirúrgicas y fórceps, retire los coágulos y otros tejidos de la superficie de la tráquea y córtelos en un centímetro cuadrado. Incubar el tejido traqueal en una solución de proteinasa a 37 grados centígrados. Después de 40 minutos, agite el tubo varias veces y use un colador de células de 40 micrones para eliminar los tejidos restantes.
Enjuague la tráquea picada en un colador con cinco mililitros de medio de expansión. Centrifugar la suspensión traqueal a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y resuspender el pellet en ocho mililitros de medio de expansión. Cuente las células viables usando azul de tripano y el hemocitómetro.
Placa de suspensión celular P0 en una placa de 100 milímetros, prerecubierta con colágeno de cola de rata. Cultive las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
