Una vez que las células epiteliales primarias de las vías respiratorias murinas alcanzan el 80% de confluencia, las células se asientan en un portaobjetos de vidrio recubierto con colágeno de cola de rata. Luego, agregue paraformaldehído para fijar las células durante 12 horas. Lave el portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada una y colóquelo en incubación con 3% de albúmina sérica bovina y 0,1% de Triton X-100 en PBS durante una hora.
Agregue el anticuerpo anti-citoqueratina pan, a una dilución de uno a 500, en el portaobjetos e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave el portaobjetos tres veces con solución de PBS durante cinco minutos cada uno antes de incubar con el anticuerpo secundario a una dilución de uno a 1.000 durante dos horas en la oscuridad. Después de lavar el portaobjetos con PBS, agregue DAPI en una dilución de uno a 1, 000 e incube durante 15 minutos.
Lave el portaobjetos una vez con PBS durante cinco minutos. Observe el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia para comparar los patrones de expresión con un control positivo y un control negativo. Después del desprendimiento y la centrifugación, vuelva a suspender las células de la fase P2 en un volumen adecuado de medio de expansión. Pipetear un mililitro de suspensión celular en la cámara apical del inserto de membrana de policarbonato Transwell.
Añada 1,5 mililitros de medio de proliferación al compartimento basal del Transwell. Incubar las células a 37 grados centígrados hasta alcanzar la confluencia. Prepare 50 mililitros de medio de diferenciación completo utilizando los siguientes componentes.
Burbujea un cigarrillo a través de 12,5 mililitros de medio de diferenciación y luego fíltralo a través de un filtro de vertido de 0,22 micras para preparar extracto de humo de cigarrillo o CSE. Para garantizar la estandarización entre experimentos y lotes de CSE, mida la absorbancia a 320 nanómetros en un espectrofotómetro. A continuación, retire el medio de expansión de la cámara apical y basal de Transwells.
Añadir un medio de diferenciación que contenga una concentración adecuada de CSE para estimular las células epiteliales murinas primarias de las vías respiratorias durante 28 días. Durante la incubación, lavar la cámara apical dos veces por semana con PBS y sustituir el medio de la cámara basal por un medio de diferenciación recién preparado que contenga CSE. Las células epiteliales de las vías respiratorias murinas se diferenciaron con éxito en una interfaz aire-líquido en 28 días.
La presencia de células ciliadas y caliciformes se demostró mediante un ensayo de inmunofluorescencia del marcador de cilios, alfa tubulina acetilada y el marcador de células caliciformes mucina 5AC, respectivamente. La viabilidad celular a las 24 horas con concentraciones variables de CSE demostró que las células epiteliales disminuyeron cuando la concentración fue superior al 6%La actividad celular bajo estimulación a largo plazo no mostró muerte celular significativa con concentraciones de CSE del 2%4% y 6%. Pero se observaron cambios en la resistencia transmembrana y las células exfoliadas.
Además, se observó una reducción general de las células diferenciadas y las células ciliadas cuando los cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias murinos se expusieron crónicamente a la CSE.
