Para empezar, tiñe las células de la médula ósea murina con Hoechst 33342. Para la citometría de flujo, inicie el software requerido y, a continuación, seleccione la estandarización de control de calidad. Inserte el tubo de muestra FluoroSphere de control de calidad o QC en el soporte del tubo antes de seleccionar iniciar para comenzar el procedimiento de control de calidad.
Para crear un nuevo experimento, haga clic en Nuevo experimento en el menú Archivo, especifique la ruta del archivo y guarde el experimento. A continuación, seleccione Establecer canal en el menú Configuración. Seleccione la casilla de verificación señal de canal y agregue el nombre del reactivo en la columna de la etiqueta.
A continuación, haga clic en el icono de gráficos de pseudo color en el área de trazado para crear gráficos. Haga clic en agregar tubo en la pantalla del tubo de ensayo para crear nuevos tubos de muestra y cambiar sus nombres. A continuación, seleccione Ejecutar para cargar la muestra, ver las parcelas y establecer las puertas.
Ajuste la configuración de ganancia y umbral y seleccione Grabar para guardar los datos. Para diseñar la lógica de configuración de la puerta, haga clic en el eje x para seleccionar FSEW y haga clic en el eje y para seleccionar FSEA. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta A para rodear la celda individual y excluir las celdas adherentes.
Para la segunda gráfica, haga clic en el eje x para seleccionar FSEA y haga clic en el eje y para seleccionar SSEA. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta B para separar las celdas no fragmentarias y excluir los residuos celulares. Para el tercer gráfico, haga clic en el eje x para seleccionar PIA y haga clic en el eje y para seleccionar SSEA.
Después de dibujar la puerta B, seleccione las células vivas que presenten yoduro de propidio negativo y dibuje la puerta C para obtener células vivas. Para la cuarta gráfica bidimensional, haga clic en el eje x para seleccionar Hoechst Red y, y haga clic en el eje y para seleccionar Hoechst Blue. Haga clic con el botón derecho en el gráfico y seleccione Propiedad en el menú desplegable.
Seleccione el formato lineal para el eje x y el eje y y dibuje la puerta para las celdas de población laterales. Utilice los láseres de 355 nanómetros y 405 nanómetros simultáneamente para detectar tanto las células de control como las células experimentales. Adquiera señales fluorescentes en los canales de 690 por 50 y 450 por 50 nanómetros correspondientes a los dos láseres.
Observe la estimulación efectiva del colorante Hoechst 33342 con láseres de 355 y 405 nanómetros para visualizar las células de población del lado claro. Para las mismas muestras, utilice los láseres de 375 nanómetros y 405 nanómetros para la detección de células. El láser de 355 nanómetros excitó eficazmente el tinte Hoechst 33342, lo que resultó en una observación clara de las células SP de la médula ósea.
Se descubrió que las células SP de las mismas muestras detectadas por el láser de 355 nanómetros y el láser de 405 nanómetros eran esencialmente idénticas. Tanto los láseres de 375 nanómetros como los de 405 nanómetros excitaron eficazmente el Hoechst 33342 para obtener células SP.
