Este trabajo fue apoyado por las subvenciones a J.H. de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81800207). La asistencia de Beckman Coulter, Inc. en la prestación de apoyo para la citometría de flujo y la calibración de parámetros es muy apreciada. Agradecemos a Jiao Chen del Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Orales del Hospital de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan, y a Yu Qi del Centro de Investigación de Medicina Regenerativa del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, por su asistencia en la adquisición de datos de citometría de flujo.

Los experimentos de este estudio utilizaron un total de 10 ratones C57BL/6 de entre 8 y 12 semanas de edad. Las operaciones experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo que fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan (#201609309). Los materiales experimentales y los parámetros de citometría de flujo utilizados en este artículo se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Aislamiento y recolección de células de médula ósea de ratón
<ol><li>Eutanasia de ratones en estricta conformidad con las directrices institucionales. Para inducir la inconsciencia en el ratón, administre anestésicos inhalatorios comenzando con isoflurano al 2%, seguido de un aumento gradual de la dosis a isoflurano al 5% hasta el cese de la respiración.</li>
	<li>Disecciona los ratones en el quirófano o en la vitrina de gases. Limpiar y esterilizar los ratones con etanol al 70%.</li>
	<li>Corta completamente la piel y el músculo de la pierna con unas tijeras afiladas y disecciona los fémures.</li>
	<li>Triture el fémur suavemente con una varilla de molienda en un mortero y enjuague las células de la médula ósea con medio DMEM hasta que el hueso se vuelva blanco.</li>
	<li>Filtre las células de médula ósea obtenidas con un filtro de 100 μm en tubos de 15 mL. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y lise los glóbulos rojos residuales con 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 1 min a 4 °C. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, lavar de nuevo con medio DMEM.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en 2 mL de solución de incubación (medio DMEM + 5% FBS), cuente las células con un contador automático de células y ajuste la concentración celular a 1,0 x 106 células/mL con solución de incubación.</li>
</ol>2. Tinción celular
<ol><li>Complemente 2 mL de suspensión de células de médula ósea de cada ratón con 5 μg/mL de Hoechst 33342. A otra alícuota de 1 mL, añadir 100 μM de verapamilo como control negativo.</li>
	<li>Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 90 min con agitación suave cada 30 min.</li>
	<li>Después de la incubación, enfríe las células en hielo durante 5 min y luego centrifuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en una solución de funcionamiento en frío (HBSS + 2% FBS). Centrifugar a 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet celular resultante en 500 μL de solución corriente por muestra. Antes del análisis de FCM, suplementar las células con 2 μg/mL de yoduro de propidio (PI) y colocarlas en hielo durante aproximadamente 5 min.</li>
</ol>3. Citometría de flujo
NOTA: Para obtener un resumen de los diversos sistemas y configuraciones utilizados, consulte la Tabla 1.
<ol><li>Calibrar los valores del coeficiente de variación (CV) de los canales requeridos utilizando fluorosferas de control de calidad (QC) diario en los FCM y realizar pruebas de muestra después de completar con éxito el control de calidad.<ol><li>Seleccione el acceso directo del software del escritorio e inicie el software.</li>
		<li>Seleccione Iniciar control de calidad/estandarización en el menú Control de calidad/Estandarización para acceder al experimento de control de calidad.</li>
		<li>Inserte el tubo de muestra de fluorosferas QC en el soporte del tubo.</li>
		<li>Seleccione Iniciar para cargar el ejemplo y comenzar a ejecutar el procedimiento de control de calidad. Los FCM están listos para su uso después de que se apruebe el control de calidad.</li>
	</ol></li>
	<li>Excite el colorante Hoechst 33342 de las mismas muestras con un láser de 355 nm, 375 nm y 405 nm, respectivamente, para la detección del rojo de Hoechst en el canal de 690/50 nm y del azul de Hoechst en el canal de 450/50 nm.<ol><li>Para crear un nuevo experimento, seleccione Nuevo experimento en el menú Archivo, especifique la ruta del archivo y guarde el experimento.</li>
		<li>Seleccione Establecer canal en el menú Configuración. Seleccione la casilla de verificación de señal de canal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) y, a continuación, añada el nombre del reactivo en la columna Etiqueta (Y585: PI; V450: Azul Hoechst-405 nm; V660: Hoechst rojo-405 nm; NUV450: Azul Hoechst-375 nm; NUV660: Azul Hoechst-375 nm; UV450: Azul Hoechst-355nm; UV660: Azul Hoechst-355 nm).</li>
		<li>Haga clic en los iconos Pseudo Trazados de color en el área de trazado para crear trazados. Seleccione un nombre de eje para cambiar el canal que se muestra.</li>
		<li>Haga clic en Agregar tubo en la pantalla Tubo de ensayo para crear nuevos tubos de muestra y cambiar sus nombres.</li>
		<li>Seleccione Ejecutar para cargar la muestra, ver las gráficas y establecer las puertas. Ajuste la configuración de ganancia y umbral. Seleccione Grabar para guardar los datos.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseñe la lógica de configuración de la puerta.<ol><li>Para el primer trazado, haga clic en el eje X para seleccionar FSC-W y haga clic en el eje Y para seleccionar FSC-A. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta A para rodear la celda individual y excluir las celdas adherentes (Figura 1A).</li>
		<li>Para el segundo trazado, haga clic en el eje X para seleccionar FSC-A y haga clic en el eje Y para seleccionar SSC-A. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta B para separar las celdas no fragmentarias y excluir los desechos celulares (Figura 1B).</li>
		<li>Para el tercer gráfico, haga clic en el eje X para seleccionar PI-A y haga clic en el eje Y para seleccionar SSC-A. Seleccione la puerta del polígono para dibujar la puerta D. Seleccione las células vivas que exhiben PI negativo (Figura 1C) y dibuje la puerta C para obtener células vivas.</li>
		<li>Para el cuarto gráfico bidimensional, haga clic en el eje X para seleccionar Hoechst Red y haga clic en el eje Y para seleccionar Hoechst Blue. Haga clic con el botón derecho en el gráfico y seleccione Propiedad en el menú desplegable. Seleccione Formato lineal f o ambosel eje X y el eje Y. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta SP para obtener celdas SP (Figura 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Para evaluar la elegibilidad de la muestra, utilice 355 nm de un citómetro de flujoespecífico 23 para la detección de células SP.</li>
	<li>Utilice los láseres de 355 nm (potencia del láser: 20 mW) y 405 nm (potencia del láser: 80 mW) simultáneamente para detectar tanto las células de control (con verapamilo añadido) como las células experimentales.</li>
	<li>Adquiera señales de fluorescencia en los canales de 690/50 nm y 450/50 nm correspondientes a los dos láseres. Observe la estimulación efectiva del colorante Hoechst 33342 mediante láseres de 355 nm y 405 nm con células SP claras (Figura 2B-C).</li>
	<li>Para las mismas muestras, utilice los láseres de 375 nm (potencia del láser: 60 mW) y 405 nm (potencia del láser: 80 mW) para la detección de células.</li>
</ol>

Método alternativo de excitación láser para una fácil detección de células de población lateral

<ol>
	<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1.">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li><li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle.">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li><li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells.">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li><li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential.">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li><li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity.">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li><li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+'side+population'.">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li><li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells.">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li><li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+stem+cells:+still+an+elusive+entity.">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64 (2017).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination.">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322 (2022).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties.">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178 (2021).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system.">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+PTEN/mTOR/STAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance.">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population.">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136 (2022).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway.">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538 (2021).</li><li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines.">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658 (2021).</li><li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform.">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li></ol>

No se declaran conflictos de interés.

Utilizamos el protocolo descrito para llevar a cabo tres experimentos, con cada ensayo con 3-4 ratones, lo que resultó en un total de 10 ratones. La proporción de células SP osciló entre el 0,05% y el 0,76%. Es importante tener en cuenta que se observaron variaciones individuales entre los ratones. Utilizamos cuatro citómetros de flujo para analizar las muestras de Hoechst. Se observa que la excitación del colorante de Hoechst por un láser de 20 mW a 355 nm en la nueva versión de la citometría de flujo es equiva...

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). Las células SP se caracterizan por el bombeo del tinte de ADN fluorescente fuera de las células a través de su transportador de casete de unión a ATP (ABC) 1,2. El método se estableció originalmente para aislar células madre hematopoyéticas (HSC) de médula ósea murina1. Las células SP de médula ósea se enriquecieron con una población de HSCs caracterizadas por CD117+Sca-1+Lin-Thy1 de baja expresión 3,4. A partir de entonces, el método se utilizó ampliamente para aislar y enriquecer células madre de otros tejidos, como el músculo cardíaco5, el hígado6, el pulmón7, el riñón8 y el prosencéfalo9. En particular, el método se ha aplicado para aislar células madre cancerosas (CSC) en la última década. Las CSC representan una pequeña población de células que poseen las propiedades de iniciación tumoral, autorrenovación, resistencia a la quimioterapia y potencial metastásico10. Las CSC se identificaron inicialmente en neoplasias malignas hematopoyéticas11 y posteriormente se observaron en varios tumores sólidos como los carcinomas de próstata12, ovario13,14 gástrico,15 de mama y pulmón16. A pesar de la disponibilidad de varias técnicas para la identificación de CSC, la técnica SP sigue siendo una opción preferida debido a su amplia aplicabilidad en diversos tejidos y líneas celulares. Además, es una técnica valiosa que aísla CSCs utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)16,17,18. Los hallazgos experimentales demuestran que las células SP exhiben una tumorigénesis pronunciada y muestran niveles elevados de expresión de genes asociados a células madre19,20. Nuestro estudio previo21 también ha demostrado que el análisis transcriptómico de células SP aisladas en mieloma múltiple revela un enriquecimiento de las vías de señalización asociadas con las células madre, como la vía del erizo. Mientras tanto, realizamos análisis de enriquecimiento de vías sobre los genes expresados diferencialmente en las células SP de la leucemia mielógena aguda22. Los genes alterados se enriquecieron en vías relacionadas con las células madre (Wnt/β-catenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Encontramos que las células SP 1 x 105 podían formar tumores en ratones BALB/c nulos22, mientras que las células no SP no podían, lo que indica que las células SP tenían características de células madre de leucemia. La eficacia del método Hoechst SP en la identificación de CSCs es evidente.
El protocolo SP de Hoechst se ha perfeccionado y mejorado a lo largo de la investigación. El protocolo implica un control estricto de la concentración de colorante, la densidad celular, la temperatura y la duración de la incubación, la composición del tampón y el valor de pH. Las muestras de células preparadas de acuerdo con este protocolo se sometieron a análisis de citometría de flujo. Debido a la excitación del colorante de Hoechst con un láser UV a 355 nm y a la detección de su emisión de fluorescencia utilizando un filtro de 690/50 nm (Hoechst Red) y un filtro de 450/50 nm (Hoechst Blue), se requiere un láser de 350 nm para FCM. Sin embargo, los láseres de 350 nm no suelen equiparse en la mayoría de los FCM debido a su alto coste. Por lo tanto, intentamos encontrar un enfoque alternativo para la excitación del colorante para la detección efectiva de células SP mediante citometría de flujo. En este estudio, se evaluó la capacidad de los láseres de 375 nm y 405 nm para detectar células SP y se comparó con la del láser de 355 nm. Nuestros hallazgos demuestran una notable similitud entre las células SP detectadas por los láseres de 355 nm, 375 nm y 405 nm. Estos resultados sugieren que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden servir como alternativas viables al láser de 355 nm para la detección de células SP. La inclusión de fuentes de luz de excitación adicionales para Hoechst 33342 facilita el uso de más modelos de citometría de flujo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>1M1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filter(100 &#181;m)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CSS-013-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daily quality control fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30030.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective detection of hoechst side population cells by flow cytometry

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). El método SP de Hoechst se utiliza para el aislamiento de células madre en función de las propiedades de eflujo de colorante de los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC). El método se empleó inicialmente para la identificación y el aislamiento de células madre hematopoyéticas (HSC), pero ahora ha evolucionado para centrarse principalmente en la identificación y el aislamiento de células madre cancerosas (CSC). El método de detección tradicional de FCM utiliza un láser de 355 nm para excitar el tinte y detectar células SP. A través de este estudio, hemos identificado con éxito enfoques alternativos para la excitación del colorante que pueden reemplazar eficazmente la detección de células SP utilizando un láser de 355 nm. Esto se logra mediante la utilización de láseres de alta potencia de 375 nm o 405 nm. Esto nos permite ejercer una selectividad mejorada en la detección de células SP en lugar de limitarnos únicamente a la citometría de flujo láser de 355 nm.

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The SP cells are characterized by the pumping of the fluorescent DNA dye out of the cells through their ATP-binding cassette (ABC) transporter1,2. The method was originally established for isolating murine bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs)1. The bone marrow SP cells were enriched with a population of HSCs characterized by &#160;CD117+Sca-1+Lin-Thy1low&#160;expression3,4. Thereafter, the method was widely used to isolate and enrich stem cells from other tissues, including cardiac muscle5, liver6, lung7, kidney8, and forebrain9. In particular, the method has been applied to isolate cancer stem cells (CSCs) in the past decade. CSCs represent a small population of cells that possess the properties of tumor initiation, self-renewal, resistance to chemotherapy, and metastatic potential10. CSCs were initially identified in hematopoietic malignancies11 and subsequently observed in various solid tumors such as the prostate12, ovarian13, gastric14, breast15, and lung16 carcinomas. Despite the availability of various techniques for CSC identification, the SP technique remains a favored choice owing to its broad applicability across diverse tissues and cell lines. Moreover, it is a valuable technique that isolates CSCs using fluorescence-activated cell sorting (FACS)16,17,18. The experimental findings demonstrate that SP cells exhibit pronounced tumorigenicity and display elevated expression levels of stem cell-associated genes19,20. Our previous study21 has also demonstrated that transcriptomic analysis of isolated SP cells in multiple myeloma reveals enrichment of signaling pathways associated with stem cells, such as the hedgehog pathway. Meanwhile, we performed pathway enrichment analyses on the genes differentially expressed in the SP cells of acute myelogenous leukemia22. The altered genes were enriched in stem cell-related pathways (Wnt/&#946;-catenin, TGF-&#946;, Hedgehog, Notch). We found that 1 x 105 SP cells could form tumors in BALB/c null mice22, whereas non-SP cells could not, indicating that SP cells had characteristics of leukemia stem cells. The efficacy of the Hoechst SP method in the identification of CSCs is evident.
The Hoechst SP protocol has been refined and enhanced through the progression of research. The protocol entails stringent control of the dye concentration, cell density, incubation temperature and duration, buffer composition, and pH value. The cell samples prepared in accordance with this protocol were subjected to flow cytometric analysis. Due to the excitation of Hoechst dye with a UV laser at 355 nm and detection of its fluorescence emission using both a 690/50 nm filter (Hoechst Red) and 450/50 nm filter (Hoechst Blue), a 350 nm laser is required for FCM. However, 350 nm lasers are not commonly equipped in most FCMs because of their high cost. Hence, we attempted to find an alternate approach for&#160;dye excitation for the effective detection of SP cells by flow cytometry. In this study, the capability of the 375 nm and 405 nm lasers in detecting SP cells was assessed and compared with that of the 355 nm laser. Our findings demonstrate a remarkable similarity between the SP cells detected by the 355 nm, 375 nm, and 405 nm lasers. These results suggest that the high-power 375 nm and 405 nm lasers can serve as feasible alternatives to the 355 nm laser for SP cell detection. The inclusion of additional excitation light sources for Hoechst 33342 facilitates the use of more flow cytometry models.

Autor destacado: Técnicas láser innovadoras para la tinción de Hoechst para analizar células de población lateral

Detección eficaz de células poblacionales del lado de Hoechst mediante citometría de flujo

We use the Hoechst stain population method to detect tumor initiating cells. In this paper, we're trying to find alternative approaches for Hoechst excitation. We found that the high power 375 nanometer and 405 nanometer lasers can serve as feasible alternatives to the traditional 355 millimeter laser.Conventionally, the Hoechst dye is excited with a UV laser at 355 nanometer. Due to the high cost of the UV lasers, they're not commonly equipped in most flow cytometry models. Our protocol expands a range of the lasers that can be used to detect Hoechst staining.For researchers focusing on normal and malignant stem cells, more models of flow cytometry can be used to detect cytopopulation cells.

En la Figura 2, el grupo de control fue tratado con verapamilo, que bloquea los transportadores ABC en las células madre para evitar la eliminación de Hoechst 33342. De este modo, las células madre del grupo no verapamilo expulsan Hoechst 33342 y forman una población de células negativas conocidas como células SP. El láser de 355 nm excitó eficazmente el colorante Hoechst 33342, lo que resultó en una observación clara de las células SP de la médula ósea (Fig...

Aquí, demostramos que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden excitar eficazmente Hoechst 33342 y servir como una alternativa viable al láser de 355 nm para la detección de células de población lateral (SP), ampliando así la gama de láseres disponibles en aplicaciones de citometría de flujo.

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

486 vistas.  Sichuan University. Utilizamos el método de población de tinción de Hoechst para detectar células iniciadoras de tumores. En este artículo, estamos tratando de encontrar enfoques alternativos para la excitación de Hoechst. Descubrimos que los láseres de alta potencia de 375 nanómetros y 405 nanómetros pueden servir como alternativas viables al láser tradicional de 355 milímetros.Convencionalmente, el tinte Hoechst se excita con un láser UV de 355 nanómetros. ...

Video: Autor destacado: Técnicas láser innovadoras para la tinción de Hoechst para analizar células de población lateral

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized for the isolation of stem cells based on the dye efflux properties of ATP-binding cassette (ABC) transporters. The method was initially employed for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs), but it has now evolved to primarily focus on the identification and isolation of cancer stem cells (CSCs). The traditional detection method of FCM uses a 355 nm laser to excite the dye to detect SP cells. Through this study, we have successfully identified alternative approaches for dye excitation that can effectively replace the detection of SP cells using a 355 nm laser. This is achieved through the utilization of high-power 375 nm or 405 nm lasers. This allows us to exercise enhanced selectivity in the detection of SP cells rather than being solely limited to the 355 nm laser flow cytometry.

Here, we show that high-power 375 nm and 405 nm lasers can effectively excite Hoechst 33342 and serve as a viable alternative to the 355 nm laser for side population (SP) cell detection, thereby expanding the range of available lasers in flow cytometry applications.

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Staining Mouse Bone Marrow Cells with Hoechst to Detect Side Population Cells by Flow Cytometry

To begin, obtain bone marrow cells from the mouse and add five micrograms per milliliter Hoechst 33342 to two milliliters of cell suspension. Prepare the negative control tube as well. Incubate in a water bath at 37 degrees Celsius for 90 minutes with gentle agitation every 30 minutes After incubation, cool the cells on ice for five minutes, and then centrifuge at 250G for five minutes at four degrees Celsius.Resuspend the cells in a cold running solution containing Hank's Balanced Salt Solution with 2%FBS. Centrifuge again at four degrees Celsius for five minutes. Next, resuspend the resulting cell pellet in 500 microliters of running solution per sample.Prior to flow cytometry analysis, supplement cells with two micrograms per milliliter of propidium iodide, and place them on ice for approximately five minutes.

Tinción de células de médula ósea de ratón con Hoechst para detectar células de población lateral mediante citometría de flujo

Flow Cytometry of Hoechst-Stained Mouse Bone Marrow Cells for Effective Detection of Side Population Using High-Power 375 nm and 405 nm Lasers

To begin, stain the murine bone marrow cells with Hoechst 33342. For flow cytometry, launch the required software, then select the QC standardization. Insert the quality control or QC FluoroSphere sample tube into the tube holder before selecting start to begin the QC procedure.To create a new experiment, click on New Experiment in the File menu and specify the file path and save the experiment. Then select Set Channel in the Settings menu. Select the channel signal checkbox, and add the reagent name in the label column.Next, click pseudo color plots icon in the plot area to create plots. Click add tube in the test tube screen to create new sample tubes and change their names. Then select Run to load the sample, view the plots and establish the gates.Adjust the gain and threshold settings and select Record to save the data. To design the gate setting logic, click the x-axis to select FSEW, and click the y-axis to select FSEA. Select Polygon Gate to draw gate A to circle the individual cell and exclude adherent cells.For the second plot, click the x-axis to select FSEA, and click the y-axis to select SSEA. Select Polygon Gate to draw gate B to separate non-fragmentary cells and exclude cellular debris. For the third plot, click the x-axis to select PIA, and click the y-axis to select SSEA.After drawing the gate B, select live cells exhibiting negative propidium iodide and draw gate C to obtain live cells. For the fourth two-dimensional plot, click the x-axis to select Hoechst Red, and click the y-axis to select Hoechst Blue. Right-click the plot and select Property from the dropdown menu.Select linear format for both the x-axis and y-axis and draw the gate for side population cells. Use the 355 nanometer and 405 nanometer lasers simultaneously to detect both the control cells and the experimental cells. Acquire fluorescent signals at the 690 by 50 and 450 by 50 nanometer channels corresponding to the two laser.Observe the effective stimulation of Hoechst 33342 dye with 355 and 405 nanometer lasers to visualize the clear side population cells. For the same samples, use the 375 nanometer and 405 nanometer lasers for cell detection. The 355 nanometer laser effectively excited the Hoechst 33342 dye, resulting in clear observation of SP cells of bone marrow.The SP cells of the same samples detected by the 355 nanometer laser and the 405 nanometer laser were found to be essentially identical. Both 375 nanometer and 405 nanometer lasers effectively excited Hoechst 33342 to obtain SP cells.

Citometría de flujo de células de médula ósea de ratón teñidas con Hoechst para la detección eficaz de la población lateral mediante láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm