Para comenzar la transformación de las células de Escherichia coli BL21 DE3, descongele 50 microlitros de alícuota de suspensión celular competente en hielo. Agregue un microlitro de ADN de plásmido pET 28a Sumo TRF2 a la suspensión celular competente y agite suavemente el tubo para mezclar la suspensión. Después de la transformación, esparcir 100 microlitros de la suspensión celular en una placa de agar luria bertani, o LB, que contenga 50 microgramos por mililitro de kanamicina.
Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, elija una colonia de las células transformadas y cultíquela en cinco mililitros de medio LB, suplementado con 50 microgramos por mililitro de kanamicina. Incubar durante 18 horas a 37 grados centígrados, con agitación a 220 RPM.
Después de la incubación, inducir el cultivo con un milimolar de IPTG como concentración final. Incubar a 20 grados centígrados durante 17 horas para promover la expresión de proteínas. Cargue los extractos de proteína cruda, junto con el tampón de carga, en un gel SDS-PAGE.
Ejecute las muestras inicialmente a 100 voltios durante 30 minutos, seguido de 120 voltios durante 50 minutos en un tampón de trisglicina. A continuación, teñir con azul de Coomassie para visualizar la expresión de la proteína. Para la purificación de proteínas, centrifugar el extracto de proteína cruda a 38.000 g durante 40 minutos a cuatro grados centígrados y filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros.
Cargue el sobrenadante filtrado en la columna de níquel preequilibrada en el tampón de unión. Lavar la columna con tampón de unión y eluir la proteína con el gradiente de imidazol preparado, recogiendo 12 fracciones de un mililitro cada una. Agregue glicerol hasta una concentración final del 50% al concentrado y tampón de la proteína intercambiada para el almacenamiento.
La expresión de TRF2 en Escherichia coli se demostró con éxito, como lo muestra SDS-PAGE, donde aparecieron bandas distintas correspondientes a TRF2 antes y después de la inducción.
